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1、o利用免疫学技术可以检测细菌、真菌、病毒 、寄生虫、各种毒素、蛋白 o还可检测激素、药物残留、抗生素及其他生 理活性物质 1酶免疫技术ELISA检测技术 ELISA o全称：酶联免疫吸附测定（enzyme- linked immuno sorbent assay） p将抗原抗体的特异性与酶反应的敏感性相结 合，使得食品在未经分离提取的前提下，即 能进行定性或定量检测 p广泛用于细菌、真菌、病毒、寄生虫、各种 毒素等大分子蛋白，以及激素、农兽药残留 、抗生素能小分子物质的检测 可检测标本类型广泛 体液：血清、血浆、胸腹水、灌洗液、脑脊液 分泌物：唾液 排泄物：尿液、粪便等 细胞培养上清 组织匀浆
2、 1.1 ELISA 的发展历程 o免疫酶标记技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫分 析之后发展起来的一大新型的血清学技术。 o1966年，Nakane和Avrameas等分别报道用酶 代替荧光素标记抗体，建立了酶标抗体技术用于生物 组织中抗原的定位和鉴定。 o1971年，Engvall ，Van Weemen 等报道了酶 联免疫吸附试验，从而建立了酶标抗体的定量检测技 术 o目前，免疫酶标记技术已成为免疫诊断、检测和分子 生物学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。 ELISA板 酶标仪 测吸光度 ELISA是一种免疫测定技术：基于抗原抗体反应 酶联：抗原或抗体的酶标记 吸附：抗原或抗体的固相化
3、测定：加入酶反应的底物后，被酶催化成为有色产物，产物 的量与标本中受检物质的量直接相关，采用酶标仪进行测定 1.2 解释：酶联免疫吸附测定 间接法 夹心法 竞争法 捕获法 1.3 类 型 酶 抗抗 体 酶标记 抗抗体 抗体 抗原 固相载体 1.将抗原包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗体，则结合 为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗抗体，则结 合为抗原-抗体-酶标记抗抗体 复合物。 4.酶催化底物并显色。 （1）间接法 间接法测抗体 洗涤 洗涤 洗涤 待测抗体 酶标抗抗体 病原体抗体的检测而进行传染病的诊断 （2）双抗体夹心法 固相载体 抗体 抗原 酶 抗体 酶标记抗体 1.将抗体包被在固
4、相载体上。 2.如样品中含有抗原，则结合 为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗体，则结合 为抗体-抗原-酶标记抗体复合 物。 4.酶催化底物并显色。 夹心法测抗原 洗 涤 洗 涤 洗 涤 待测抗原 在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原 ，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等 产品举例 o氟苯尼考（FF）ELISA快速检测试剂盒 （ Green Spring ） o可用于动物组织（肌肉、肝脏）、尿液、血 清、蜂蜜、肠衣、牛奶以及水产品等样品中 氟苯尼考药物残留的检测。 o人金黄色葡萄球菌肠毒素(SE) ELISA 检 测试剂盒 （3）酶标抗原竞争法 固相载体 抗体 抗原
5、酶 酶标记抗原 1.将抗体包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗原，则优先 竞争结合抗体，结合 为抗原抗体复合物。 3.同时加入酶标记抗原，抗原 没有结合的位点酶标记抗原 去占据，则结合为酶标记抗 原-抗体复合物。 4.酶催化底物并显色。 抗原 竞争法测小分子抗原 洗涤 洗涤 待测抗原 酶标抗原 小分子激素、药物等ELISA测定多用此法 。 4 捕获法示意图 酶 抗体 酶标记 抗体 抗原 抗抗体 固相载体 抗体 1.将抗抗体包被在固相载体上 。2.如样品中含有抗体，则结合 为抗抗体-抗体复合物。 3. 加入抗原及酶标记抗体， 则结合为抗抗体-抗体-抗原- 酶标记抗体复合物。 4.酶催化底物并显
6、色。 固相抗IgM 特异IgM 非特异IgM 标本 特异抗原 抗原特异酶标抗体 底物 此法常用于病毒性感染的早期诊断。 捕获法 1.4 操作流程 o将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为包 被(coating)。 o 蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结 合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与 固相载体表面的疏水基团间的作用。 o大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的 疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。 （1） 包被 包被的条件 pH9.6碳酸盐缓冲液 pH7.2的磷酸盐缓冲液 pH7-8的Tris-HCL缓冲液。 o 加入包被液后，在4-8冰箱中放置过夜， 37中保温2小时。包被浓
7、度随载体和包被物的性 质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结 合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为 10ng/ml-20ug/ml。 （2）封 闭 o封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋 白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关 的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤 中干扰物质的再吸附。 o常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清 或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用 （5%）。 o 所有的ELISA固相均需封闭。 （3）加样 o在ELISA中一般有3次加样步聚 o即加样本，加酶结合物，加底物。 o加样时应将所加物加在LEI
8、SA板孔的底部，避免 加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气 泡。 （4）保 温 o抗原抗体完成反应的保温过程称为温育 o应注意温育的温度和时间应按规定力求准确 。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜 多于两块板同时测定。 （5）洗涤 o洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着 实验的成败。 oELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。 o清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的 干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的 ，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤 下来。 o可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。 (6)显色 o显色
9、是酶催化无色的底物生成有色产物的温 育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的 因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色， 而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当 提高温度有助于加速显色进行。 酶 o在ELISA中，可以采用的有HRP，AP，葡萄糖氧 化酶，-D-半乳糖苷酶和脲酶等。 oHRP（辣根过氧化物酶）是一种糖蛋白，含糖 量约为18%，分子量为44000，是一种复合酶， 由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合 而成，是一种卟啉蛋白质。 底物 oHRP的底物 o DH2+ H2O2 D+ 2H2O oDH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色 的产物。 oDH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联
10、苯胺 (TMB)等。 oOPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反 应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高 oTMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较 稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混 和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由 蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸 收波长为450nm。 1.5ELISA 影响因素 固相载体：ELISA 中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板。 抗原：可溶性、优质、稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。 试验样品：血清、血浆或其他体液，均可作为 ELISA 的试验样品。 结合物：酶结合物要求稳定，具有很高的酶活性，抗原或抗体的特异性 ，产量高及成本
11、低。 底物：各种酶都有对底物的特异性，不同种类的酶要求有不同的底物。 作用时间：加底物后终止时间？ 结果判断:ELISA 的试验结果可用肉眼观察颜色反应的深浅作出判断，也 可用分光光度计作精确测定。 试验的重复性（精确度） ：通常用变异系数来表示。 思考：如何研发商品化的 ELISA试剂盒？ 需要什么原料，得到哪些组分 ，摸清哪些条件，才能够进行 组装？ 2免疫胶体金技术 （胶体金试纸条检测技术、胶体金层析） 大肠杆菌O157:H7快速检测 试纸（胶体金） 2.1 简 介 胶体金试纸条诊断是采用胶体金免疫层 析技术研制而成，该技术是90年代初在免疫 渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免 疫学
12、检测技术，最先用于人绒毛膜促性腺激 素（HCG）的测定和乙型肝炎病毒表面抗原 （HBsAg）等检测。 p胶体金（Colloidal gold）是氯金酸（ HAuCl4）的水溶胶，氯金酸在还原剂的作用 下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电 作用成为一种稳定的胶体状态。故称胶体金 用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径 、也就是不同颜色的胶体金颗粒 质量好的胶体金：溶液呈红色，胶体金颗粒为球 形，大小均一，无棱角。 质量差的胶体金：溶液呈紫色，大小不一，形状 各异。 胶体金的质量判定标准 p胶体金标记的原理： p胶体金在碱性条件下带负电荷，与蛋白质分 子的正电荷基团静电吸引而形成牢固结合。
13、p胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸 附到胶体金颗粒表面的包被过程。 p标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红 色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中 2.2胶体金试纸条诊断技术的原理 以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜 的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢 慢向另一端渗移，通过抗原抗体结合，并利 用胶体金呈现颜色（红色）反应，检测抗原/ 抗体。 检测线 质控线 吸收垫 样品垫 硝酸纤维素膜 胶体金垫 背衬 （底板） 胶体金试纸条示意图 2.3 分类 o间接法-测抗体 o双抗夹心法-测大分子抗原 -食品中沙门氏菌的检测 o竞争法-测小分子抗原 -食品中瘦肉精、黄曲霉
14、毒素的检测 沙门氏菌单克隆抗体 可能含有 沙门氏菌 的样品 （1）双抗夹心法检测抗原测大分子抗原 沙门氏菌多 克隆抗体 抗抗体 （2）思考 o竞争法的原理？ o检测线喷的是纯化的抗原，与待 检测抗原竞争 o这种情况下的结果判定？ 2.4 胶体金快速诊断技术的特点 p简捷快速：操作简单，一般只要5-10min 就会 出结果，而其它方法如ELISA需要1-2h，PCR 需要时间更长。 p结果易于判定：阴、阳性呈色很明显，肉眼很 容易判断。 p特异性好：因为该技术大多用单克隆抗体标记 ，这决定了它具有很好的特异性。 2.5 技术分项 样品垫 吸水垫 粘性底板 NC膜 胶体金垫 干燥方法 抗原抗体生物
15、原料 胶体金制备 标记技术 溶液喷点 溶液体系分析 装配切条包装 （1）金标垫与样品垫的处理 o1，金标垫裁剪成长10，宽8长条 o2，样品垫裁剪成长30，宽2.5长条 o3，将裁剪好的金标垫与样品垫，分别用金标垫 处理液与样品垫处理液浸润，放入37温箱中烘 干储存在干燥器中置4冷库中备用。 抗体 Antibody 来源差异: 鼠抗,兔抗和羊抗 种类差异: 单抗,多抗 腹水的处理: 饱和硫酸铵沉淀法 特异性:亲和层析柱 浓度: 浓缩 溶解液:不含盐,例如PB （2）抗原抗体生物原料 抗原 Antigen 偶联抗原物质: BSA, OVA等 毒品检测来源: 合成抗原 （3）标记技术 Conjug
16、ate 容器硅化处理 金颗粒制备 (负电) 颜色与颗粒的关系. 最佳标记颗粒大小40nm. 蛋白质最适用量测定:盐析法 （4）胶体金制作流程 1，向硅化过的三角瓶中加入100ml去离子水，再加入1ml浓度 为1%的氯金酸 2,将三角瓶放入微波炉中加热，沸腾时取出，一次性迅速加入 1850l浓度1%柠檬酸三钠，摇动约20s（柠檬酸三钠经0.22滤膜 过滤） 3,再将三角瓶放入微波炉中大火1分钟，调中火继续加热五分 钟。 4，拿出来冷却，待温度降至室温时用去离子水补足到100ml, 用0.1M的碳酸钾调节PH至略高于待标记蛋白的等电点，0.22过 滤转移至硅化过的平底蓝盖瓶中。 5，蓝盖瓶中放入搅拌子，搅拌，向金溶液中加入蛋 白,标记量为2g/ml，缓慢加入标记蛋白。 6,搅拌,半小时后加入浓度为10%的BSA至终浓度为 0.2%，继续搅拌一小时。 7，将标记好的溶液转至50ml
