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1、第七眉海峡雨岸嗅菌孥挈衍研讨舍输文集5 5 4 2 一棰同畴测定9 倜P M P 衍生化罩糖的改良H P L C 方法及其在巫芝菌绦髓多醣组成分析中的庶用 裼晓彤1李绪全1糜可1周月琴1於小明2 榻鏖竞1 1 上海师鲍大擘生命舆瑗境科挈院微生物舆免疫单研究所，上海市，中圆 2 上海榻裼百草研究所，上海市，中圆 摘要 本文研究了罩糖1 一苯基一3 - 甲基一5 一毗唑啉酮( 1 一p h e n y l 一3 一m e t h y l 一5 一p y r a z o l o n e ，P M P ) 衍生物的H P L C 分析 保件，送用C 1 8 反相柱，碓定用1 5 和4 0 ( V 厂v
2、 ) 乙腈的磷酸疆衡液( 5 0m m o l L ，p H6 9 ) 作属流勤相 A 和B 造行二元梯度洗脱，梯度属：睛蠲0 m i n 一2 5 m i n 一2 7 r a i n 一3 0 m i n 畴，相愿流勤相B 百分 潢度属1 8 一2 5 一1 0 0 一1 0 0 o 测定流速1 0m L m i n ，梭测波畏属2 5 0n m ，柱温2 5 0 Co 六槿 申| 生糖，2 槿糖醛酸和1 倜氨基葡萄糖共9 租罩糖的P M P 衍生物可在骸傈件下同峙得到分雕和定量榆 测。逼用敖方法，五獯曩芝液髓骚酵菌糸糸髓多醣T F A 水解物中罩糖俎成也成功地遭行了测定，裙果鼗 现G a
3、 n o d e r m al u c i d u m 、Go e r s t e d i i 、Gr e s i n a c e u m 、Gs u b a m b o i n e n s e 和G 如u g a e 菌糸糸髓多醣中均主 要由葡萄糖、牛乳糖、甘露糖及少量氨基葡萄糖组成，不同的墓芝多醣邃分别有鼠李糖、木糖、岩藻 糖和葡萄糖醛酸及牛乳糖醛酸存在，但在罩糖敷和摩丽比上均不相同。 丽鼹祠：1 - 苯基- 3 甲基一5 一毗唑啉酮衍生、高效液相、罩糖、霪芝o 1 = = = 二 日U舀 多醣不懂是粗成生物楼髓的重要大分子， 许多更具有蕖理活性。真菌震芝( G a n o d e r m
4、 a ) 所彦生的多醣已被嚣明具有免疫翮 售f i 、抗艟瘤、霞肝、清除自由基、抗血栓、 抗血脂、翻箭血糖等多獯有益健康的活性 ( 李舆裼，2 0 0 3 ：L i na n dZ h a n g ，2 0 0 4 ) o 多醣的基本徂成秸樽罩位是罩糖，其穗颊 和连接方式决定了多醣的化犟秸棒和性赞， 因此封罩糖组成连行分析可属研究多醣提供 最基本和重要的资飘。罩糖分析方法目前使 用得比较普遍的有氯相色藉( G C ) 、高效液 相色藉( H P L C ) 和凝腾鼋泳( F l u o r o p h o r e - a s s i s t e d c a r b o h y d r a t
5、e - e l e c t r o p h o r e s i s ，F A C E ) 或毛糸田管鼋泳( C E ) 等( Y a n ge ta 1 ，1 9 9 5 ； Z h a n ge ta 1 ，2 0 0 3 ；K h a n d u r i n a 2 0 0 4 ；B e n t i v e g n a ，2 0 0 4 ) o 相封而雷，氯相色稽和高效 液相色稽在精碓定量分析方面更估傻剪 ( L i u ，2 0 0 4 ；Z h a n ge ta 1 ，2 0 0 3 ) o 然而罩糖在氯 相色藉分析前需要造行繁璜耗睛的衍生魔 理，而且某些成分如葡萄糖糖醛酸等舍在衍
6、生遇程中往往我生蒋燮而不能得到正碓分析 ( C h u r m sS C 1 9 9 0 ) o 罩糖用H P L C 分析如果不逢行衍生化魔理 则又因属罩糖不具有强紫外吸收只能用示差 梭测器等梭测，限制了分析霾敏度oH o n d a ( 1 9 8 9 ) 等人我现，遗原性罩糖能在温和保件 下舆1 - 苯基一3 - 甲基5 毗唑啉酮( 1 p h e n y l 一3 m e t h y l 一5 - p y r a z o l o n e ，P M P ) 反臆，虚生的罩 糖- P M P 衍生物具有强紫外吸收，能用紫外 榆测器迤行高囊敏度桧测，监且具有衍生化 筒罩方便的傻黠，得到了魔泛
7、臆用( Y u a n ， 2 0 0 3 ；Z h a n ga n dS u z u k i ，2 0 0 3 ；S h e ne ta 1 ， 5 6第七眉海峡雨岸真菌罩罩衍研讨畲输文集 1 9 9 8 ) o 但是，目前已鞭溥的H P L C 傈件只 能榆测5 7 槿罩糖，监且封中性罩糖、酸性 罩糖或氨基罩糖的分析需要分成畿倜不同测 定倏件才能完成，不利於檬品的快速分析 ( 餍等，2 0 0 2 ；Z h a n ge ta 1 ，2 0 0 3 ；F ua n d O N e i l l ，19 9 5 ) o 本文封P M P 衍生罩糖的H P L C 分析傈件 逢行了馒化，使嗅菌
8、多醣中常兄的9 獯罩 糖，包括6 槿中性罩糖、2 獯糖醛酸和1 槿 氨基糖能麴同睛得到分析测定。臆用孩方 法，我们封 G a n o d E ? r m al u c i d u m 、G o e r s t e d i f 、Gr e s i n a c e u m 、Gs u b a m b o i n e n s e 和Gt s u g a e 五桓冀芝的液髓袋酵菌采糸髓胞 内多醣遘行了罩糖粗成分析，监舆目前得到 魔泛研究的Gl u c i d u m 和G 擂u g a e 多醣罩糖 租成遣行比较，霜簖邃新的曩芝多醣、一步 嗣拓重芝槿霓资源提供寅黢依掾。 材料舆方法 材料 1 苯基3
9、甲基一5 比唑啉酮( 1 p h e n y l 一3 m e t h y l 一5 一p y r a z o l o n e ，P M P ) ，磷酸和甲醇赙 自上海化挈弑剖公司。三氟醋酸( t r i - f l u o r o a c e t i ca c i d ，T F A ) 、正丁醚及9 槿罩糖 檩犟品，计有葡萄糖( g l u c o s e ，G l c ) ，甘露糖 ( m a n n o s e ，M a n ) ，牛乳糖( g a l a c t o s e ，G a l ) ，木 糖( x y l o s e ，X y l ) ，岩藻糖( f u c o s e ，F
10、 u c ) ，鼠李 糖( r h a m a o s e ，R h a ) ，葡萄糖醛酸( g l u c u r o n i c a c i d ，G I c U A ) ，牛乳糖醛酸( g a l a c t u r o n i ca c i d ， G a l U A ) 和盥酸氨基葡萄糖( g l u c o s a m i n eh y d r o c h l r i d e ，G I c N ) 均属S i g m a 公司鏖品。色 稽赧乙腈媾自F l u k a 公司oH y p e r s i lB D S C 1 8 高效液相柱( 4 6m m 2 5 0m m ) 属E
11、l i t e 公司 蘑品oG a n o d e r m al u c i d u m ( G L ) 、Go e r s t e d i i ( G O ) 、Gr e s i n a c e u m ( G R ) 、Gs u b a m b o i n - e n s e ( G S ) 和G ( G T ) 共5 穗重芝的液髓培蓑 茵褓髓多醣由上海舒筑大犟微生物舆免疫犟 研究所提供。 罩糖的衍生化虞理 按H o n d a ( 1 9 8 9 ) 等人的方法连行，略有改 勤。具髓霜：辈碓稽取上逍9 桓罩糖檩犟 品，分别用甲醇配成潢度属1 0m g m L 的溶 液。每獯罩糖各取1 0
12、 灿混合於1 5m L 的 雕心管中，6 0 0 C 水浴撺斡甲醇後每管均加 入0 5m o l L 的P M P 甲醇溶液和O 3m o l L 的N a O H 水溶液各4 0 皿，混匀，方八7 0 。C 水浴中连行衍生化反t | 9 耋；o 两小睛後加入4 0 此的H C l ( 0 3m o l L ) j 冬止反臆。遇量的 P M P 用1m L 正丁醚萃取除去，重梭3 次。 罩糖一P M P 衍生物所在的水相用3 0 0 此蒸船 水稀释後，程O 2 2H m 的滤膜遇滤，遭 H P L C 分析o H P L C 分析憬件 探用B e c k m a nS y s t e mG o
13、 l d 高效液相色稽 系梳，包括1 2 5 液相泵和1 6 8D A D 榆测 器。流勤相A 蔫1 5 ( V ) 乙腈磷酸鞭衡液 ( 5 0m m o l L ，p H6 9 ) ：流勤相B 属4 0 ( V ) 乙腈磷酸粳衡液( 5 0m m o l L ，p H 6 9 ) ：梯度模式：睛圈属0m i n 一2 5m i n 一 2 7m i n _ 3 0m i n 峙，相臆渡度梯度属1 8 _ 2 5 _ 1 0 0 一1 0 0 流勤相Bo 连檬髓 稹属2 0 止，流速属1 0m L m i n ：桧测波畏 属2 5 0l l m ：柱温：2 5 。Co 方法穗定性舆重徨性研究
14、上述9 租罩糖混合檬品程P M P 衍生後， 以加入H C l 格止反臆的睛筒计属0 小畴，分 别在1 、2 4 、4 8 、7 2 小畴在相同H P L C 傈件 下连檬分析，测定礁定9 槿罩糖檩辈品衍生 物的稳定性情沉。 魉芝菌练艟多醣的罩糖组成分析 分别稀取上述5 獯墓芝菌蒜髓胞内多醣， H P L C 测定鬟芝徂成 用蒸馏水配成1m g m L 溶液。取lm L 置方八 安培瓶中，加入1m LT F A ( 8m o l L ) 封管後 在1 2 0 0 C 水解6 小睛。水解麈物中加入5 m L 甲醇，减匿蒸斡，重梭5 _ 6 次到黛酸味 止，水解彦物蒸斡，用1m L 蒸馏水溶解 後
15、，取1 0 0 此至1 5m L 的塑骖雕心管中， 在乾燥器中真空掉斡水分。残渣按上逋罩糖 的衍生化方法遭行衍生魔理，监在相同 H P L C 傈件下遭行分析。 根掾檬品出峰敷及舆保留睛同，舆檩辈罩 糖比较後碓定多醣中罩糖组成的穗颊，韭根 撼各罩糖峰的峰面稹用蹄一化法计算罩糖的 摩雨敷( 罩糖峰面稹百分比除以分子量) ，监 以甘露糖( M a n ) 的摩雨敷作属1 ，计算各罩 糖同摩雨比。 藉果 辈糖檩翠品P M P 衍生物的H P L C 分雕 九槿罩糖檩犟品艇P M P 衍生後，凿探用 文献保件( Z h a n ge ta 1 ，2 0 0 3 ) 畴，即用乙 腈：1 0 0m m o
16、 lp H6 0 磷酸疆衡液( 7 5 ：2 5 ) 等 度洗脱，H y p e r s i lB D S C t 8 反相柱未能将各 罩糖峰有效分雕( 圆1 ) ，罩糖峰互相重叠。 桎遇封乙腈配比、磷酸疆衙液渡度和p H 傈 件遭行嗣整馒化，我现用15 ( v v ) ( 流勤 相A ) 和4 0 ( v v ) 乙腈磷酸粳衡液( 5 0 m m o l L ，p H6 9 ) 和( 流勤相B ) 二元梯度洗 脱，探用梯度模式属0m i n 一2 5m i n 一2 7 m i n _ 3 0m i n 畴相臆流勤相梯度属1 8 一 2 5 一1 0 0 一1 0 0 流勤相B ，可将九獯 罩糖衍生物分雕阴束( 圃2 ) o 在此保件下，罩糖出峰次序依次属甘露 糖( M a n ) 、盟酸氨基葡萄糖( G l c N ) 、鼠李糖 ( R h a ) 、葡萄糖醛酸( G I c U A ) 、牛
