食品第二章-光谱及色谱

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1、第二章 光谱及色谱分析,一、光谱产生的原理,室温下物质主要处在它们的电子能级和振动能级的基态。当不同能量的电磁波照射物质时，物质的分子或原子吸收一定波长的电磁波后从基态跃迁到激发态，然后这些激发态通过在各个方向上以相同的或较低的频率发射出所吸收的辐射，或者通过“无辐射”弛豫释放能量，一般在10-8s左右回到基态。,二、紫外-可见吸收光谱,1、概述 紫外-可见吸收光谱（ultraviolet-visible absorption spectra)是分子吸收紫外-可见光区10-800nm的电磁波而产生的吸收光谱，简称紫外光谱（UV）。 其中10-190nm为原紫外区（真空紫外区），190-400n

2、m为近紫外区（石英紫外区），400-800nm可见光区。 分子中价电子经紫外或可见光照射时，电子从低能级跃迁到高能级，此时电子就吸收了相应波长的光，这样产生的吸收光谱叫紫外光谱。,可以跃迁的电子有：电子, 电子和n电子。跃迁的类型有： *, n *, *, n *。, *，对应10-190nm的远紫外区； n *, *, n *，对应190nm以上的近紫外区和可见光区； 常见的紫外谱图波长范围为200-400nm。,既然一般的紫外光谱是指近紫外区，即 200-400nm， 那么就只能观察 *和 n *跃迁。也就是说紫 外光谱只适用于分析分子中具有不饱和结构的化合物。,紫外-可见吸收光谱的特点,

3、测量灵敏度和准确度高； 应用范围广； 对多种金属元素和非金属元素及其化合物都能进行测定 能定性或定量测定大部分有机化合物； 仪器价格便宜； 操作简单快速。,2、基本原理,通过测定吸收池中溶液对某个波长范围单色光的吸收强度，可以获得紫外-可见吸收光谱。实际的波长范围是190-400nm(紫外区)和400-780nm(可见光区)。,透射比（透光率）T：,以透光率对波长的函数作图，即得到所需样品的光谱图，可以通过透射率进行定量和定性分析，但透光率并不直接正比于样品溶液中有吸收的待测组分浓度，而是吸收带的强度（吸光度）正比于吸收池中光照部分吸光质点的数目。,吸光度A： Lamder-Beer定律： A

4、正比于光吸收池厚度b(cm)、溶液浓度c(mol/L)以及摩尔吸光系数L/(molcm)。 对于给定的体系，在低浓度(c0.1mol/L)时，A和样品浓度之间存在线性关系。但在高浓度时，由于样品内分子间距离变小，其相互作用增强并影响电荷分布，这种分子间的微扰明显地影响待测组分捕获特定波长的能力， 可能发生变化，使之偏离线性工作曲线。,3、仪器,（1）光度计 单道系统：仅用一个检测器，单色器缓慢扫描通过光谱时，它依次测量每一个分辨单元的强度。高分辨率时对应较窄的狭缝，200-400nm用氘灯，400nm以上用钨灯。 多道系统：阵列检测器（n个硅二极管），所有强度的光谱被同时测量，测量时间减小至1

5、/n，信噪比增加 倍。 不需要窄的狭缝，200-800nm均使用氘灯。,（2）滤光片,在光度计中，用一个或多个干涉滤光片代替贵重的单色器元件，使得系统适合于在指定波长下的特定应用。 图2-4是典型的光纤光度计的实验装置，适用于可见光范围，不需要将样品装入吸收池再放入光度计，而是将光度计放在样品中，进行原位样品测量。,4、操作条件,（1）样品制备 样品需要有代表性 为了防止由于浑浊溶液的光散射所产生的“吸收”，有必要先对溶液进行澄清处理。 参比池溶剂的选择 （2）分析操作 确定比色池,（3）测定波长的选择 最好选择在待测组分的最大吸收波长处测定，因为此处吸光度值不随波长变化，且灵敏度高，更符合L

6、amder-Beer定律。,5、标准曲线,根据标准曲线可确定待测组分的浓度与吸光度之间的关系，标准溶液最好采用与待测样品相同的试剂同时制备。,6、仪器误差对吸光度测定精密度的影响,（1）仪器误差：仪器噪声。 （2）在极高或极低的透光率范围内测定的误差较大，通常选用中间值的透光率测定。 （3）一般分光光度计上定量测定的最佳吸光度范围为0.2-0.8（或透光率15%-65%）。通常待测样品的吸光度应在小于1.0取值。,三、荧光光谱,1、概述 当紫外线照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见光，而当紫外线停止照射时，所发射的光线也随之很快地消失，这种光线称为荧光。,2、荧光光谱

7、分析,荧光光谱法的灵敏度比一般的吸收光谱法高1-3个数量级，所测得的信号是待测组分由激发电子弛豫到其对应的基态时发射的电磁辐射。 激发和钝化过程是同时发生的。对每个单一分子体系，都有一个供样品激发的最佳波长和另一个用于检测荧光发射的更长的波长。用于激发和发射的波长取决于待测体系的结构和化学性质。 荧光仪和荧光分光光度计中包含两个波长选择器：一个用于激发光束；另一个用于发射光束。 当激发态的物质与气体分子碰撞时可产生荧光猝灭现象。,荧光束辐射能(PF): 其中：PF:荧光比色池产生的光束的辐射能； ：荧光量子效率或量子产率（等于荧光物质吸收辐射后所发射的荧光的光子总量与吸收激发光的光子总数的比值

8、）； P0：入射光束的辐射能； P：投射出的光束的辐射能。 量子产率对任何一个给定系统都是定值。,其中：摩尔吸光系数，L/(molcm); b光程，cm; c待测组分的浓度，mol/L。 当待测组分的浓度很低时，bc0.01，PF可写为： 进一步归类为： 其中比例常数 假设待测组分的浓度很低，且其他参数不变，此时荧光信号直接正比于待测组分浓度,四、红外光谱和拉曼光谱,红外光谱和拉曼光谱都属于分子振动光谱。 （一）红外光谱 1、概述 红外光谱是固体或液体或气体对不同频率的红外辐射吸收形成的光谱。,2、红外光谱的基本原理,1）电磁光谱的红外区域 近红外光谱12500-4000cm-1(0.8-2.

9、5m) 红外光谱 中红外光谱4000-400cm-1 (2.5-25m) 远红外光谱400-10cm-1 (25-1000m),用于O-H、N-H、 C-H 等官能团的定量分析,有机化合物分子的振动跃迁基频,分子的转动光谱以及重原子成键、氢键和一些络合物、超分子化合物的非共价键的振动光谱,2）分子振动 一个分子如果沿着它的电荷分布方向振动时，其电荷分布也就是电偶极矩会发生变化，则这个分子可以产生红外辐射吸收。 伸缩振动 造成偶极矩变化最重要的振动： 弯曲振动 变形振动,3）影响分子振动频率的因素,式中： v振动量子数(0,1,2,)；h普朗克常量； k键力常数，N/cm；m1、m2原子重量。,

10、分子处于振动基态(v=0)，分子吸收电磁波后从基态跃迁到第一激发态(v=1),此时吸收的辐射频率正好等于键的初始频率，这种跃迁的吸收频率称为基频。 分子吸收2倍或3倍基频的辐射频率，跃迁到第二激发态或第三激发态(v=2或3)。由振动基态到第二激发态的吸收频率称为倍频或泛频。 当电磁波能量正好等于两个或更多基频跃迁能量的总和时，则可能同时激发两个倍频或多个基频振动到相应激发态，这种吸收称为和频。 如辐射电磁波的能量等于两个基频跃迁能量的差时，所产生的频率等于这两个基频频率之差的吸收谱带，称为差频。 合频：和频和差频的统称。,3、中红外光谱,1）中红外光谱仪 色散型红外光谱仪 傅里叶变换红外光谱仪

11、 红外显微镜,2）样品的制备技术,液体样品：选用光程为0.01-0.1mm液体池 固体样品： 气体样品：使用气体池测定。,固定池,可拆池,其他特殊池,压片法,糊状法,溶液法,薄膜法,衰减全反射法,3）中红外光谱的应用,有机官能团的吸收谱带 综合吸收峰位置、谱带强度、谱带形状及相关峰的存在可反映出各种官能团的存在与否。 一般将红外区分为官能团区（3700-1350cm-1）和指纹区（1350-650cm-1）两部分。,中红外光谱的表征,定性分析,采用计算机检索或通过与中红外建立的标准谱图比较，寻找与待测样品化合物最匹配的化合物。 定量分析 灵敏度较低，误差较大； 样品不用分离，也不受样品状态的限

12、制。,4、近红外光谱,近红外光谱(near infrared spectroscopy, NIR)归属于中红外光谱基频的倍频及合频，只有中红外光谱的基频在2000cm-1以上的振动才能在近红外区出现一级倍频。 食品分析在近红外光谱测定的波长范围为0.7-2.5m。,1）漫反射技术测定的原理,漫反射是一部分光透过样品表面后进入样品内部，并经样品颗粒反射回到样品表面。漫反射以0-180的任何角度从样品表面辐射，每一次辐射都与样品发生相互作用，样品中的化学组分也可能吸收部分辐射。 漫反射光包括样品组分和各化学成分的结构信息，采用特定波长下的能量的吸收值来表示。 样品颗粒的大小和形状直接影响辐射进入或

13、离开样品表面的光量。,2）NIR区的吸收谱带,红外光谱主要归属于中红外基频的倍频及合频，因此强度较弱。但食品中的主要成分中通常含有-OH、-NH、-CH等基团，在NIR区域均可观察到足够的强度。,3）仪器,近红外光谱根据样品的不同类型可分别测定反射率和透光率。其中反射方式主要用于固体或粉末样品的测定。,大多数食品样品的制备是将其紧密填充在样品池中的石英窗上，这样就提供了一个可发生反射的光滑、均匀的表面。 反射率R=I/I0 I设定波长下待测样品的反射光强度； I0参比物在相同波长下的反射光强度。 R值通常情况下以lg(1/R)表示，反射率测定有时也可用相邻波长所得反射率的差值或推导值表示，即l

14、gR2-lgR1,或2lgR2-lgR1-lgR3。 NIR液体样品通常采用透射法测定。,4）NIR光谱的定量分析,NIR光谱谱峰较宽，样品中各种成分的吸收重叠严重，因此定量时每种成分需要在2个或2个以上波长处测定才可靠。 组分含量(%)=Z+alg(1/R1)+blg(1/R2)+clg(1/R3)+ 式中的每一项表示在不同波长下，用相应的系数经多次测定得到的光谱测定值，每一个系数和截距采用多元线性回归方程确定。,4）NIR光谱的定性分析,采用判别分析方法，比较未知样品的NIR光谱与标准样品NIR光谱的差异，然后讲样品归类于光谱最相似的官能团。,5）NIR光谱的在食品分析中的应用,谷物和油料

15、种子种蛋白质、水分和含油量的测定。 鲜肉和加工肉制品、家禽和鱼类制品中的水分、蛋白质和脂肪的测定。 食品中糖类和有机酸的测定。,（二）拉曼光谱,红外光谱是吸收光谱，而拉曼光谱是散射光谱。 1、拉曼光谱的原理 瑞利散射散射光的波长与入射光波长相同。 拉曼散射效应当光子与分子发生非弹性碰撞时，在大于和小于入射光波长的两侧出现一系列散射线，这种现象称为拉曼散射效应。 斯托克斯线若分子处于振动能级的基态，在与光子碰撞进行能量交换后，分子被激发到较高的不稳定的准激发态，然后又回到振动的第一激发态，此时发射的光子能量小于入射光光子的能量，就产生斯托克斯线，其频率为：,反斯托克斯线若光子与处于第一振动激发态

16、的分子发生碰撞，分子将一部分能量交给光子而回到振动基态，则散射光频率大于入射光频率，产生反斯托克斯线，其频率为：,2、拉曼光谱的特征谱带及强度,拉曼活性取决于振动中极化度是否变化，只有极化度有变化的振动才是拉曼活性的，及拉曼效应与产生诱导偶极矩变化的振动相联系。 拉曼光谱中官能团谱带的频率与其在红外光谱中出现的频率基本一致。极性强的基团极化度很低，将产生强的红外光谱、弱的拉曼光谱，反之亦然。,3、拉曼光谱的应用,有利于提高重原子的振动信息； 对红外吸收很弱的碳碳三键、碳碳双键、C-S、S-S等键的伸缩振动及其他对称振动的模式都有很强的拉曼散射强度。 拉曼光谱制样简单，很多情况下，样品不需要处理。 水可作为溶剂。,五、质谱,1、概述 质谱是使样品分子（或原子）在电离室中带上电荷，这种将分子转化为离子