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1、中南大学 硕士学位论文 ANXA1、ANXA4、CA1在不同临床分期结直肠癌中表达模式的研究 姓名：李楠 申请学位级别：硕士 专业：内科学 指导教师：王晓艳 20100501 硕士学位论文 中文摘要 摘要 【背景和目的】 结直肠癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤，目前缺乏有效、特异 的结直肠癌分子诊治疗靶标，从而严重限制了临床上结直肠癌综合治 疗效果的提高。为了筛选高灵敏度、高特异性的有助于结直肠癌早期 诊断及预后判断的特征分子群，明确结直肠癌发生发展过程中分子群 变化的时空规律，建立结直肠癌分子分型的模式，本研究组在前期工 作利用高通量芯片技术及组学技术在转录、转录后及翻译水平筛选出 了不同临床
2、分期结直肠癌差异表达的分子群；比对各层面的差异分子 群及各分子在不同临床分期结直肠癌中的表达模式，我们发现 A N X A 4 、C A l 及A N X A l 在转录、转录后及翻译水平的表达模式基 本一致，提示这三个分子在结直肠癌的发生发展中可能发挥着重要作 用，这一结果引起我们的关注。本研究将在蛋白及转录水平扩大样本 量探究者三个分子在不同临床分期结直肠癌组织中的表达情况，并分 析其与临床预后的相关性，明确这些分子在结直肠癌中的功能及表达 规律，为结直肠癌的早期诊断及预后判断提供实验依据。 【方法】 收集结直肠癌标本建立临床资料库，采用W e s t e mb l o t 在蛋白质 水平
3、分析A N X A l 、A N X A 4 、C A l 在不同临床分期、不同分化程度 的结直肠癌组织中的表达模式。在转录水平利用荧光实时定量P C R 检测目的基因在相应结直肠癌组织中的表达水平。采用K a p l a n M e i e r 生存曲线结合L O O C V 判别函数分析各分子与预后的相关性。 【结果】 ( 1 ) 在蛋白水平，A N X A l 在四期结直肠癌组织中均较正常组织中 表达上调，上调率分别为：8 8 9 ，2 2 2 2 ，5 5 5 6 和6 2 5 0 。与 自身正常对照比较，A N X A l 在I 期表达水平明显上调( P = O 0 3 7 ) ，
4、比较不同分期癌组织间的差异，发现I 期上调水平最明显，其动态表 达趋势与前期实验结果基本相符。A N X A l 在低分化腺癌与高分化腺 癌中的表达水平明显高于正常组织及中分化腺癌中的表达水平，差异 具有统计学意义( P O 0 5 ) ；与正常结直肠组织比较，A N X A 4 在不同 硕士学位论文中文摘要 分期的结直肠癌组织中表达上调，上调率分别为：8 5 7 1 ，5 7 1 4 7 1 4 3 和8 8 3 3 ，I 期、期与正常对照比较差异具有统计学意义 ( P a I u o I s s a J c|芬。案J9J u 1 3 0 J d 堡圭兰垡笙奎 一 结果 似于“勺型”，且在期
5、有最高的表达水平。( 如图3 - 9 及图3 。1 0 ) 。 0 3 o 蓉0 2 D 50 1 鲁0 o ：- 0 1 尝0 2 兽0 3 C 雳m 4 m 5 A N X A 4 困3 - 9 A N X A 4 在不同分期结直肠癌样本中的表达情况 。N o r m a l ”为将I 期患者正常组织表达量混合后的平均水平 表示与正常组织表达水平相比P 图3 一l O 前期实验运用2 1 ) - I ) I G E 筛选出的A N X A 4 在不同分期结直肠 癌样本中的动态表达趋势图S t a n d e r d 为内标；c o n t r 0 1 为正常对 照组；图中每个黑色固点表示一
6、个病人及其蛋白质的表达水平；蓝色 线条是每组样品中A N X A 4 表达水平平均值的连线 与配对正常组织比较，C A l 在不同临床分期结直肠癌组织的平均表达 水平均下调，尤其在I I I 期、期下调趋势明显。其单因素方差分析显示，组 他 加 卫 启 - 2 加 l e 牖I uo蔼笆cI苍!芍否uI鲁Jd 硕士学位论文结果 问差异亦具有统计学意义( P = 0 0 0 0 ) 。I I I 期、期的表达水平明显低于I 期、I l 期的表达水平( P 0 0 5 ) 。该结果提示C A l 在不同分期的结直 肠癌组织中的动态表达模式类似“折线”，在进展期癌症中表达水平更低， 与前期蛋白质组学
7、分析结果相符。( 如图3 1 1 及图3 1 2 ) 。 图3 - 1 1C A l 在不同分期结直肺癌样本中的表达情况“N o r m a l 。为将I 期患者正常组织表达量混合后的平均水平表示各分期与正常组织的表 达水平相比P 值均小于O 0 5 ；表示I 期的表达水平与期、期的表 达水平相比较P o碍一L coloJ阻 硕士学位论文 结果 p 一匕。一毋L c|肖一J c 9 2 L 0 硕士学位论文 结果 3 3A N X A l 、A N X A 4 、C A l 在转录水平的表达差异 目的基因在结直肠癌不同临床分期的蛋白水平呈曲线样的动态变化，并非 是单纯的升高或降低。究竟是什么原
8、因造成这种动态变化? 是否与蛋白的上游 事件转录水平的调节有关? 为了进一步了解蛋白差异表达的原因，我们利用荧 光定量P C R 检测蛋白的上游事件转录水平中目的基因在不同I 临床分期的结 直肠癌的表达情况，观察目的基因在两个层面的动态变化趋势是否相符，一方 面为下一步研究目的基因的转录调控机制奠定基础，另一方面也可验证转录组 筛选的结果。 3 3 1 检测结直肠癌组织及配对正常组织中总R N A 的质量 利用紫外分光光度计测得所有样本A 2 6 0 A 2 8 0 为( 1 8 0 7 + 0 0 1 3 ) ，提 示R N A 样品纯度合格。1 琼脂糖凝胶电泳结果显示存在清晰的2 8 S
9、及1 8 S 条带，2 8 S ：1 8 S = 2 ：l ，5 S 带亮度较淡，提示R N A 无明显降解，质量符合逆 转录要求。部分R N A 样品电泳情况见图3 1 9 2 8 S 1 8 S S S 1234567891 01 l 图3 1 91 琼脂糖凝胶电泳验证样本组织总R N A 完整性 3 A 2 逆转录模板质量鉴定 进行逆转录后形成的c D N A 模板以I B - a c t i n 为引物，以H 2 0 为阴性对照 进行普通P C R 扩增，扩增后的产物使用1 5 琼脂糖凝胶电泳，验证模板质 量。结果显示所有样本e D N A 均可扩增出特异性1 3 - a c t i
10、n 条带，凝胶电泳显 示在2 5 8 b p 的位置可见单一、清晰的条带，无引物二聚体及杂带。阴性对照 未见明显条带。部分电泳结果见图3 2 0 。 硕士学位论文 结果 2 S 8 b p M12345678 91 01 11 21 31 4 1 51 6H 2 0 图3 - 2 0 模板鉴定结果图 3 3 3 检验q P C R 反应条件 按照材料与方法中说明的反应体系及参数进行q P C R 反应，绘制标准曲 线如图3 2 1 。结果显示各引物的退火温度皆可达到较高的扩增效率，各引物 扩增效率及退火温度见表3 2 。采用此退火温度进行q P C R 扩增，得到的目 的基因扩增曲线及溶解曲线
11、见图3 2 2 及3 2 3 。溶解曲线显示为单峰，无非 特异性扩增及引物二聚体产生，提示引物特异性良好。 表3 - 2q l P c l t 反应条件及标准曲线参数 3 _ t 4 相对定量方法的确定 通过对标准曲线的分析，我们发现A N X A l 、A N X A 4 、C A l 、1 3 - a c t i n 的 标准醢线的线性度均较好，但是扩增效率不完全相同，A N X A l 的扩增效率为 1 0 8 ，A N X A 4 的扩增效率为9 5 ，C A I 与f l - a c t i n 的扩增效率分别为1 0 2 与 9 2 ，为了保证计算的精确度以减少实验误差，我们选用同
12、时考虑内参扩增数及 扩增效率的相对定量计算方法P f a f f l 法。根据P f a f f l 法计算出A N X A l 、A N X A 4 、 C A I 在不同分期结直肠癌组织中的相对表达量。 3 2 硕士学位论文结果 圈 9- 。7 田 巴 避 卜 U 为 - 5- 32 - 1 O 韧始D N A 量I l o g 值l 善- 7 2 5 圈 75_ 3z10 初始D N A 量I l o 口值) 毒 4- 21o - 9- 8 - 7 初始O 籼a i 1 叼值) - 5- - 3- 2O 祝始D M 量I o g 值I 图3 - 2 1A N X A I 、A H X A
13、 4 、C A I 、D - a c t i n 实时定量P C R 扩增标准曲线 乏 ，澎；= 缎 J膳歹 掰孽 j ；, j 。淫嚣 秘 ! 一y 一 一 墨 吣 L j、 K j 隐 患 逶 j - 曼 鼍 l 。 J I 夏弱 - K J 一l l 。乎2 o ：；鲁 一E i 器 l iF 嬲 疆娶 疆罨 疆矗 慧叠 一 熬 奠恩k 潞 飞 趣 l l -瞎啼鸣扁矗由 ：l i l l f ：l 姐，o 一 ：h 图3 2 2R e a l - ti m eP C R 分析A N X A I 在不同结直肠癌及配对正常组织中的表迭 左铡为A N X A I ；右侧为D - a c ti
14、 n 3 3 孙 避L u 答 理卜u 晕卜u 硕士学位论文结果 需f-：,m=毛Ii 一篆 ；E_F旺I l 一 = = = = = ，；雩意历雾， ” ：孵，一|7 2 | |蛰强镳圹 | 臻| 毂 i硅劲 多：么 7 - 随 卜 氏 高跫 逶i ? 写葺是 - - 胃3 - 2 3R e a l - t i m eP C R 分析A N X A 4 及C A l 在不同结直肠癌及配对正常组织中的表达 左侧为k N X k 4 ；右侧为C A l 3 3 5A N X A l 、A N X A 4 、C A l 在不同临床分期的结直肠癌组织的转录水 平的差异表达 首先我们仍将目的基因在同一
15、分期的正常组织及癌组织的表达量分别 计算平均值及标准差，再将各期数据进行对比，使用配对t 检验分析不同分 期结直肠癌组织与自身正常对照相比较，目的分子表达差异是否具有统计学 意义。我们发现，与蛋白质水平一样，在转录水平某分子在各样本问的变化 趋势并不一致，部分样本表现出在癌组织中的表达量与正常组织表达水平相 似或与该分子总体趋势相反的情况。这种现象也是在1 I 期、I I I 期较为明显。 我们发现A N X A l 在m R N A 水平与蛋白质水平具有最高上调率的分期并不 一致，提示A N X A l 在m R N A 水平的动态表达模式与蛋白质水平的表达模 式并不相符。各分子在不同分期结
16、直肠癌组织中的变化趋势总结如表3 3 表3 - 3A N X A l 、A N X A 4 、C A l 在不同结直肠癌中的表达趋势 硕士学位论文 结果 3 3 5 1 A N X A l 在不同临床分期的结直肠癌组织转录水平的差异表达 A N X A l 的m R N A 在结直肠癌组织中的表达水平总体呈上升趋势，与其 对应的正常组织相比较，I 期、I I 期、I 期癌组织中的表达量均明显高于对 照的正常组织，P 值分别为O 0 1 2 ，O 0 0 7 ，O 0 0 0 。I V 期癌组织中的表达量 与正常组织相比较，差异无统计学意义，如图3 2 4 。同样，我们将所有I 期 的正常组织的表达量计算平均
