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1、第2 6 卷增刊 2 0 0 7 年9 月 分析测试学报 F E N X I C E S H IX U E B A O ( J o u r n a lo fI n s t r u m e n t a lA n a l y s i s ) V 0 1 2 6 S e p 2 0 0 7 A n g i o p o i e t i n - - 1 基因修饰的骨髓间充质 干细胞( M S C ) 的蛋白质组学方法分析 钟丽君1 ，孙丽杰2 ，杨彬1 ，刘丹1 ，娄雅欣1 ， 彭嘉柔1 ，陈凤荣2 ，崔呜2 ( 1 北京大学医学部医药卫生分析中心，北京1 0 0 0 8 3 ；2 北京大学第三医院心内
2、科，北京1 0 0 0 8 3 ) 血管生成素( a n g i o p o i e t i n ，A n g ) 是近来发现的促血管生成的细胞因子，其家族成员包括A n g l 、 A n 9 2 、A n 9 3 、A n 9 4 。其中研究最多的是A n g l 及其受体T i e 2 。与血管内皮生长因子不同，A n g l T i e 2 系 统作用于血管生成的晚期阶段，诱导和维持内皮细胞迁移、存活，在血管新生及其稳定的过程中起了 重要的作用。A n g l 由4 9 8 个氨基酸组成，人和鼠的A n g l 有9 7 6 相同。A n g l 的主要功能是抗内 皮细胞凋亡、募集血管
3、周围细胞，维持血管稳定性及参与血管再造。成体组织中A n g l 广泛分布于肌 肉、前列腺、卵巢、子宫等富含血管的组织中，而无血管或少血管组织中A n g l 存在量较少拉j 。腺病毒 载体能够有效地将A n g l 基因转入M S C 。已有的实验证明获得的M S C A n g l 细胞能够表达分泌较高的 A n g l 蛋白，M S C A n g l 能够在急性心肌梗死大鼠心肌组织内存活，并且在一定的时间内表达外源A n g l 蛋白一。急性心肌梗死时，M S C A n g l 细胞比M S C 细胞有更强的促进血管生成的作用，并能够进一步减 小梗死面积，增加室壁厚度，改善心肌重构”
4、J 。本研究的目的是用蛋白质组学技术寻找与A n g l 相关的 差异表达的蛋白质，通过凝胶图像分析和统计学分析，确定与A n g l 相关的差异蛋白质斑点，用电喷雾 电离串联质谱技术，鉴定差异蛋白。希望能为深入研究A n g l 的作用机制提供新的线索。 1 实验部分 1 1 试剂与材料 固相p H 梯度干胶条购自美国B i o R a d 公司，序列级胰蛋白酶购自P r o m e g a 公司，乙腈( A C N ) 为J T B a k e r 公司产品，三氟乙酸( T F A ) 和甲酸( F A ) 为F l u k a 公司产品。其它均为国产分析纯，由北京大 学第三临床医院心内科
5、提供M S C A n g l 细胞和M S C 细胞。 1 2 实验仪器与软件 P R O T E A NI E FC e l l 等电聚焦电泳仪，P R O T E A Nl IX iC e l l 垂直板电泳仪，分析软件I m a g i n gM a s t e r 2 DE l i t e5 0 均为美国B i o R a d 公司产品。质谱分析系统为美国W a t e r s 公司的毛细管液相色谱仪和Q T o fU h i m aG l o b a l 质谱仪。 1 3 细胞蛋白提取 按每1 1 07 个细胞加入1 5 0 斗L 裂解液( 7m o l L 尿素，2m o l L
6、 硫脲，4 0g LC H A P S ，6 5m m o l L D T F ，2g LB i o L y t e ，蛋白酶抑制剂) ，超声破碎细胞3S ，间隔2S ，重复1 0 次，冰浴2 0m i n ，1 75 0 0 r m i n ，4 。C 离心6 0m i n ，取上清，一7 0 分装保存。蛋白质定量方法参见B i o r a d 公司提供的说明书。 1 4 双向电泳 固相p H 梯度等电聚焦凝胶电泳：将1 0 0 斗g ( 银染) 或1m g ( 考染) 细胞蛋白样品与上样缓冲液( 7m o V L 尿素，2m o l L 硫脲，4 0 LC H A P S ，6 5m m
7、o l LD T F ，2g LB i o - L y r e ，0 0 1 9 L 溴酚蓝) 混合至总体积 为3 0 0 止，加人聚焦盘中，放入1 7c m ，p H3 1 0 的I P G 胶条。水化和等电聚焦按设置的程序进行，即 被动水化1h ，主动水化5 0V1 2h ，除盐2 5 0V3 0m i n 、10 0 0V1h ，升压1 0 0 0 0V5h 。等电聚焦后的I P G 胶条在平衡缓冲液I ( 6m o l L 尿素，2 0g LS D S ，0 3 7 5m o l LT r i s H C I ，p H8 8 ，2 0 甘油，2 0g LD T Y ) 中平衡1 0m
8、i n ，然后在胶条平衡缓冲液I I ( 6m o l L 尿素，2 0g LS D S ，0 3 7 5m o l LT r i s H C I ，p H8 8 ， 基金项目：国家自然科学基金资助项目( 3 0 3 7 1 5 6 2 ) 作者简介：钟丽君( 1 9 7 6 一) ，女，吉林省吉林市人，助理研究员，硕士，T e l ：1 3 5 2 1 8 6 6 9 6 4 ，E m a i l ：z h o n g l i j u n b j m u e d u c a - - 4 7 - 第2 6 卷分析测试学报增刊 2 0 甘油，2 5g L 碘乙酰胺) 中平衡1 5m i n ，转
9、移至1 2 S D S - P A G E 的上端。 S D S P A G E ：以每一胶条1 0v m A 恒流电泳3 0m i n ，再加大电流至3 0n 诅直至溴酚蓝达到胶的底线， 取下凝胶进行固定、染色。 1 5图像分析 用A G F AD u o S c a nT 1 2 0 0 凝胶图像扫描仪扫描银染的凝胶，I m a g i n gM a s t e r2 DE l i t e5 0 图像分析软 件依次进行点检测、背景消减、匹配、量化比较从而获取斑点的相关信息。 1 6 质谱分析及数据库检索 分别筛选M S C A n g l 细胞和M S C 细胞全蛋白质组中产生稳定、差异明
10、显的蛋白质斑点，切下放入 样品管中，胰酶消化、冻干，溶于0 1 三氟乙酸。用毛细管液相色谱仪( c a p i l l a r yl i q u i dc h r o m a t o g r a p h ys y s t e m ；W a t e r s ) 及四极杆飞行时间质谱仪( Q T O FU l t i m aG l o b a lm a s ss p e c t r o m e t e r ；W a t e r s ) ，进行 C a p L C - E S IM S M S 全自动分析。自动进样系统装备一个C 1 8 脱盐预柱( 5m m 3 5 0I x m ) 和一个C 1
11、8 毛 细管柱( 1 0 0m m 7 5 m ) 。毛细管电压为34 0 0V ，在进样后的前3 5m i n 通过预柱脱盐，以后的时间 通过梯度洗脱经C 1 8 毛细管柱进行肽段分离，分离后的肽段直接进入离子源，对于每一个强度超过阈 值的肽段( 一般为主峰强度的1 0 ) 都自动进行M S M S 测定。测定后的数据经P r o t e i n L y n x2 0 ( w a t e r s ) 软件处理，通过M a s c o t ( h t t p ：w w w m a t r i x s c i e n e e c o r n ) 查询N C B I 数据库进行蛋白质鉴定。 2 结
12、果与讨论 在相同条件下对实验组M S C A n g l 细胞和对照组M S C 细胞进行了3 次双向凝胶电泳，建立2 组细 胞全蛋白的2 D 电泳图谱( 见图1 ) 。使用图像分析软件对其进行分析，结果显示M S C A n g l 细胞和M S C 细胞在蛋白质的表达上具有显著性差异。对两组电泳图进行匹配发现部分蛋白质在M S C A n g l 细胞中含 量增加，有2 个明显的蛋白质只在M S C A n g l 细胞组检测得到，6 个蛋白质在两组细胞中发生了明显变 化，共有7 个差异蛋白点得到鉴定。2 号点为“抗氧化酵素”( A n t i O x i d a n te n z y m
13、 e ) 可以直接作用在自由 基，也可以作用在铁和铜离子等减少其与自由基发生进一步反应，9 号点为2 - c y sp e r o x i r e d o x i n 是一种 细胞过氧化物酶，消除上皮生长因子作用下的内源性H ：O ：产生。这两种蛋白都与清除体内的自由基有 关。3 号点为c o f i l i n 切丝蛋白，又叫肌动蛋白解聚因子( a c t i nd e p o l y m e r i z i n gf a c t o r ) ，是可使肌动蛋白丝 不稳定的一种蛋白，既可同F 肌动蛋白结合，亦可同G 肌动蛋白结合。5 号点为R N Ab i n d i n gm o t i f
14、 ( R N P l ，R R M ) p r o t e i n3 目前对R R MR N A 结合蛋白功能的了解还不够深入，但是已经知道这一类蛋白 质参与R N A 前体的剪接、R N A 的细胞定位、R N A 维持稳定等多种转录后调控过程，6 号点为P e p t i d y l p r o l y li s o m e r a s eA ( P P I ) ，P P I 在细胞中的基本作用是通过非共价键方式，稳定扭曲的酰胺过渡态，而 催化肽基脯氨酰的顺式与反式旋转体的相互转变。1 0 号点为t r a n s g e l i n ，它是M S C s 所特有的细胞骨架 相关蛋白。已经
15、得到的结果提示A n g l 转入后使具有抗氧化功能的蛋白和参与细胞骨架形成的蛋白分泌 量增加，这可能是A n g l 具有抗内皮细胞凋亡，维持血管稳定性及参与血管再造的部分原因。 一4 8 一 图1M S C 组( a ) 和M S C A n g l 组( b ) 细胞总蛋白质的次双向凝胶电泳图谱 第8 期分析测试学报增刊 参考文献 D A V I SS ，A L D R I C HTH ，J O N E SP F ，e ta 1 I s o l a t i o no fa n g i o p o i e t i n 一1 ，al i g a n df o rt h eT I E2r e
16、c e p t o r ，b ys e c r e t i o n t r a pe x p r e s s i o nc l o n i n g J C e l l ，1 9 9 6 ，8 7 ：1 1 6 1 1 1 6 9 S U R IC ，J O N E SP F ，P A T A NS ，e ta 1 R e q u i s i t er o l eo fa n g i o p o i e t i n 一1 ，al i g a n df o rt h et i e 2r e c e p t o r ，d u r i n ge m b r y o n i ca n g i o g e n e s i s J C e l l ，1 9 9 6 ，8 7 ( 7 ) ：1 1 7 1 1 1 8 0 L IJJ ，H U A N GYQ ，B A S
