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1、上海交通大学 硕士学位论文 Akt及其下游核转录因子在胃癌耐药细胞中表达的研究 姓名：黄伟翼 申请学位级别：硕士 专业：内科学 指导教师：靖大道 20080401 IV Akt 及其下游核转录因子在胃癌耐药细胞中表达的研究 摘要 摘要 目的：目的：通过比较胃癌耐药细胞株 SGC7901/DDP 和非耐药细胞株 SGC7901 中 Akt1 及其下游核转录因子 NF-B p65、FOXO3a 表达的 变化，探讨导致胃癌耐药的 PI3K-AKT 通路的调节机制，以期为胃癌 多药耐药的防治提供理论依据。 并通过观察 Akt1 及 NF-B、 FOXO3a 在胃癌组织中的表达,探讨其与胃癌临床病理之关
2、系。 方法：方法：1. 应用化疗药物顺铂按照 0.02-1.0ug/ml 浓度梯度递增 诱导胃癌 SGC7901 细胞株，形成胃癌耐药细胞株 SGC7901/DDP。将 其培养在 DDP 浓度为 0.5ug/ml 的培养液中以维持其耐药表型。 以非 耐药细胞株 SGC7901 作对照，应用 RT-PCR 及 Western Blotting 分别 从 mRNA 水平及蛋白水平检测 Akt1、 NF-B p65、 FOXO3a 的表达差 异。分析耐药胃癌细胞中 Akt1 的变化及其与下游 NF-B、FOXO3a 的关系。 2.2.取胃癌患者的肿瘤组织标本，制成组织芯片，以非胃癌患者的 正常胃粘膜
3、活检组织为对照，检测胃癌组织与正常胃粘膜组织中 Akt1、NF-B p65、FOXO3a 的表达的差异，并进一步分析胃癌组织 中 Akt1、NF-B p65、FOXO3a 与临床病理学特征的关系，以及 Akt1 表达与其下游核转录因子 NF-B p65、FOXO3a 之间的关系。 结果：结果：1. 与与胃癌非耐药细胞株 SGC7901 相比，胃癌耐药细胞株 V SGC7901/DDP 中 Akt1、NF-B p65 mRNA 和蛋白水平的表达显著升 高 （p0.05)，而与肿瘤大小、分化程度、浸润深度、脉管浸润和远处转移显著相关。 FOXO3a 蛋白阳性表达与胃癌患者的性别、年龄、淋巴结转移、
4、分化程度及 远处转移均无明显相关性( P0.05)，而与肿瘤大小、浸润深度、脉管浸润显著相 关。(见表 7) 0.00% 20.00% 40.00% 60.00% 80.00% 100.00% AKT1NF-kBFOXO3a 阳性表达率 Normal Gastric cancer Fig8. Expression of Akt1, NF-kB and FOXO3a in normal tissues and Tissues of gastric cancer 图 8 AKT1 NF-kB 和 FOXO3a 在肿瘤和非肿瘤组织表达的差异 上海交通大学硕士论文 36 表 7. AKT1、 FOXO
5、3a 和 NF-B 蛋白在胃癌组织中的表达及其与临床病理特征的 关系 Group Cases FOXO3a NF-B AKT1 Normal gastric tissue 27 18(66.7%)* 6(22.2%)* 7 (25.9%)* Gastric cancer 168 49(29.2%) 93(55.4%) 94(56.0%) Age 60 70 23(32.9%) 41(58.6%) 37(52.9% ) 60 98 26( 26.5%) 52(53.1%) 57(58.2% ) Gender Male 112 34(30.4%) 64(57.1%) 56(50.0%)* Fama
6、le 56 15(26.8%) 29(51.8%) 38(67.9%) Tumor size 3 cm 82 36(43.9%)* 36(43.9%)* 38(46.3%)* 3 cm 86 13(15.1%) 57(66.3%) 56(65.1%) Differentiation Grade Low 102 26 (25.5%) 64(62.7%)* 71(69.6%)* High 64 23 (35.9%) 29(45.3%) 23(35.9%) Depth of invasion T1 13 5(38.5%)* 6(46.2%)* 3(23.1%)* T2 28 15(53.6%) 9(
7、32.1%) 9(32.1%) T3 49 17(34.7%) 22(44.9%) 19(38.8%) T4 78 12(15.4%) 56(71.8%) 63(80.8%) Vessel invasion Negative 104 36(34.6%)* 51(49.0%)* 45(43.3%)* Positive 64 13(20.3%) 42(65.6%) 49(76.6%) Lymph node metastasis Negative 55 20(36.4%) 25(45.5%) 20(36.4%)* Positive 113 29(25.7%) 68(60.2%) 74(65.5%)
8、Metastasis Negative 154 47(30.5%) 80(51.9%)* 82(53.2%)* Positive 14 2(14.3%) 13(92.95) 12(85.7%) *P 0.05，* P 0.01 上海交通大学硕士论文 37 A. AKT1 在正常胃组织中阴性表达(SP 法400) . A. Negative expression of AKT1 in normal gastric tissue(SP method 400) B AKT1 在高分化胃癌中阳性表达(SP 法400) . Positive expression of AKT1 in highly di
9、fferentiated gastric cancer tissue(SP method 400) A B 上海交通大学硕士论文 38 C NF-B 在正常胃组织中阴性表达 (SP 法400) Negative expression of NF-B in gastric cancer tissue (SP method 400) D NF-B 在胃癌中阳性表达(SP 法800). Positive expression of NF-B in gastric cancer tissue (SP method 800) C D 上海交通大学硕士论文 39 E FOXO3a在正常胃组织中阳性表达(S
10、P法400) Positive expression of FOXO3a in normal gastric tissue (SP method 200) F. FOXO3a在胃癌中阴性表达(SP法400) .F. Negative expression of FOXO3a in gastric cancer tissue (SP method 400) Fig9. The expression of AKT1,NF-B and FOXO3a in gastric cancer tissue and normal tissue 图 9. AKT1，NF-B 和 FOXO3a 在胃癌和胃正常组织
11、中的表达（A-F） E F 上海交通大学硕士论文 40 4.2.3 AKT1，NF-B，FOXO3a 蛋白在胃癌中表达的相关性蛋白在胃癌中表达的相关性 本组胃癌组织中 AKT1、NF-B 的蛋白表达显著上调，FOXO3a 蛋白表达水 平明显减低。168 例胃癌组织中，AKT1 蛋白阳性表达 94 例，NF-B 蛋白阳性表 达 93 例， FOXO3a 蛋白阳性表达 49 例。 其中 AKT1(+)/NF-B(+)68 例、 AKT1(+)/ FOXO3a(+)40 例、NF-B(+)/ FOXO3a(+)32 例；AKT1(-)/ NF-B(-)者 49 例， AKT1(-)/ FOXO3a(
12、-)者 65 例，NF-B(-)/ FOXO3a(-)者 58 例。两两相关性分析显 示 AKT1 与 NF-B 呈显著正相关 （r=0.569， P=0.000， 见表 8） ； AKT1 与 FOXO3a 呈显著负相关（r=-0.325，P=0.001，见表 9） ；NF-B 与/FOXO3a 亦呈显著负相 关（r=-0.287，P=0.000，见表 10） 。 表 8. AKT1 蛋白和 NF-B 蛋白表达的相互关系 NF-B AKT1 阳性 阴性 R 值 P 值 阳性 68 26 阴性 25 49 0.569 .001 表 9. AKT1 蛋白和 FOXO3a 蛋白表达的相互关系 FO
13、XO3a AKT1 阳性 阴性 R 值 P 值 阳性 40 54 阴性 9 65 -0.325 0.01 表 10. NF-B 蛋白和 FOXO3a 蛋白表达的相互关系 FOXO3a NF-B 阳性 阴性 R 值 P 值 阳性 32 61 阴性 17 58 -0.287 0.05)，而与性别、肿瘤大小、分化程度、浸润深度、脉管浸润、淋巴结转移 和远处转移显著相关(P0.05)，而与肿瘤大小、分化程度、浸润深度、脉管 浸润和远处转移显著相关(P0.05)， 而与肿瘤大小、 浸润深度、脉管浸润显著相关(P0.05)。 （见表 7） 。以上临床资料显示三种蛋白 在肿瘤的发生发展中起重要的作用，参与肿
14、瘤浸润和转移，可能通过继发性的引 起相关基因或蛋白表达改变引起肿瘤细胞增殖能力的改变。 本组胃癌组织中 AKT1、NF-B 的蛋白表达显著上调，FOXO3a 蛋白表达水 平明显减低。 168 例胃癌组织中， AKT1 蛋白阳性表达 94 例， 阳性表达率为56.0%， NF-B 蛋白阳性表达 93 例，阳性表达率为55.40%，而正常胃组织分别为 25.9%和 22.2%，进一步证实胃癌组织中 Akt1 表达明显上调，而且发现 AKT1 与下游 NF- B 存在共表达97，提示了两者之间上下游的紧密联系。FOXO3a 蛋白阳性表达 49 例，阳性率为 29.2%，显著低于正常胃组织（66.7%
15、） 。胃癌组织中 FOXO3a 表达，与 AKT1 和 NF-B 表达呈显著的负相关。其中 AKT1(+)/NF-B(+)68 例、 AKT1(+)/ FOXO3a(+)40 例、NF-B(+)/ FOXO3a(+)32 例；AKT1(-)/ NF-B(-)者 49 例，AKT1(-)/ FOXO3a(-)者 65 例，NF-B(-)/ FOXO3a(-)者 58 例。而同时从临 上海交通大学硕士论文 43 床资料上可以看出， 上述三种蛋白的表达在具有侵袭性和转移的肿瘤患者表现明 显的相关性， 提示 Akt1 和 NF-kB 以及 FOXO3a 亦可作为临床上判断肿瘤恶性程 度的分子标志98。 两两相关性分析显示 AKT1 与 NF-B 呈显著正相关 （r=0.569， P=0.000，见表 8
