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1、温州医学院 硕士学位论文 ADMA对内皮生长晕细胞凋亡及其相关p38丝裂素活化蛋白激酶表 达的影响 姓名：夏雪 申请学位级别：硕士 专业：内科学（心血管内科） 指导教师：张怀勤;杨德业 20100501 温州医学院硕士学位论文 A D M A 对内皮生长晕细胞凋亡及其相关p 3 8 丝裂素活化 蛋白激酶表达的影响 中文摘要 目的：探讨非对称性二甲基精氨酸( A D M A ) 对内皮生长晕细胞( E O C s ) 凋亡 和粘附能力的影响以及凋亡相关p 3 8 丝裂素活化蛋白激酶( p 3 8M A P K ) 表达水平 的变化。 方法：采用密度梯度离心法分离脐血中的单个核细胞，接种至预先用人
2、纤维连接 蛋白包被2 h 的6 孔培养板，采用己添加多种特定生长因子的含1 0 胎牛血清的 E G M 2 培养液诱导分化培养。培养2 4h 后用H a n k s 液轻柔洗去未贴壁细胞，贴 壁细胞加上述培养基继续培养。此后一周内每2 4h 更换一半培养液，一周后每 7 2h 换全液并于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。待铺路石样细胞生长汇合 后传代，扩增后取第二代细胞采用免疫组化法鉴定细胞表达C D 3 4 、F l k 1 、V I I I 因子相关抗原的情况，通过激光扫描共聚焦显微镜观察细胞的D i I 。a c - L D L 、 F I T C U E A I 双荧光染色结果以鉴定所
3、培养细胞的内皮属性。 取第二代E O C s 按1X1 0 5 个孔密度接种至6 孔板中并分为五组：( 1 ) 对照 组：使用配制A D M A 的溶剂( 含I P B S 的E G M 2 培养基) 与细胞共同孵育4 8 h ； ( 2 ) A D M A 各浓度干预组：分别用含l 、5 、1 0 、3 0p m o l LA D M A 的E G M 一2 培 养基与细胞共同孵育4 8 h 。 将上述五组细胞分别采用A n n e x i n V F I T C P I 双染色法行流式细胞仪检测细 胞凋亡率；D A P I 染色和A n n e x i n V F I T C P I 双染
4、色法在激光扫描共聚焦显微镜下 观察细胞凋亡形态的改变；在倒置显微镜下观察计数各组重粘附细胞数检测细胞 粘附能力；取对照组以及A D M A5 、1 0 、3 0g m o l L 处理组用特异性的P h o s p h o p 3 8 M A P K 、t o t a lp 3 8M A P K 抗体的蛋白免疫印迹法( W e s t e mb l o t ) 检澳S J p 3 8M A P K 的活性。 结果：脐血中分离获得的单个核细胞在诱导培养第4 6 天开始出现梭形细胞，第 6 8 天左右形成若干个小的细胞集落，细胞形态变为典型的鹅卵石形，细胞由中 心到外周延展呈椭圆形铺路石样排列，同
5、时细胞增殖进入高峰期。在1 5 - 2 0 d 左 右各个集落相互融合，布满整个六孔板底部。 免疫组化染色显示所培养细胞的C D 3 4 、F l k 1 、V I I I 因子相关抗原表达阳性 温州医学院硕士学位论文 率均为1 0 0 。 激光扫描共聚焦显微镜观察细胞双染色结果表明，所培养的细胞具有成熟内 皮细胞的特性，能吞噬a c - L D L 并结合U E A - I 。当细胞吞噬D i I a c - L D L 时在绿光激 发下发出红色荧光，细胞结合F I T C U E A Il e c t i n 在蓝光激发下发出绿色荧光。 以上观察鉴定结果表明，从脐静脉血分离获取的单个核细胞
6、经含特定生长因 子的E G M 一2 培养基诱导分化培养并传代后，细胞基本上为纯的E O C s 。 A n n e x i n V F I T C P I 双染流式细胞仪检测凋亡率表明，与对照组相比，1 - 3 0 l a m o l LA D M A 可呈浓度依赖性的诱导E O C s 的凋亡( 氏O 0 1 ) 。 通过D A P I 染色在激光共聚焦显微镜下观察细胞核形态，发现与对照组相比， A D M A 处理组可出现部分染色质浓缩、细胞核呈碎块状浓染等细胞凋亡形态学改 变；通过A n n e x i n V P I 双染色法在激光共聚焦显微镜下观察细胞形态，发现与对 照组相比，A
7、D M A 处理组亦可见到更显著的细胞膜完整性缺失等凋亡改变。 在细胞粘附能力方面，与对照组相比，1g m o l LA D M A 对E O C s 的粘附能力 无明显影响( 1 8 7 0 4 9 3V S1 9 7 5 6 0 0 ，P 0 0 5 ) ，5 3 0r u n o l LA D M A 显著抑 f l ；f J E O C s 的粘附能力( 尸 取9 2m l E G M - 2 培养液，加入胎牛血清8m l ，即为含10 F B S 的E G M 2 培 养液( E G M 一2 培养液本身含有2 的胎牛血清) 。 加入l m l1 0 0 青霉素一链霉素溶液。 即为含
8、有1 0 胎牛血清、青霉素( 1 0 0U m 1 ) 及链霉素( 1 0 0U m 1 ) I 拘E G M 2 培养液。 用无菌管分装，存于4 冰箱备用。 2 人纤维连接蛋白的配置 J 1 l m l 无菌P B S 于含1m g 人纤维连接蛋白( H F N ) 粉末的小瓶中，充分混 匀，将其移到5 0 m l 无菌离心管中。 J 【1 1 9m l 无菌P B S 稀释上述H F N 溶液至5 0g g m l ，用无菌管分装，存于4 冰箱备用。 3 A D M A 溶液的配置 取1 0 m g 的A D M A 标准品，为白色固体粉末，分子量2 7 5 1 8 ，溶于2m lP B
9、S 。 再用无菌P B S 将上述溶液定容至3 6 3m l ，即为1l a m o l m l 的A D M A 标准液， 温州医学院硕士学位论文 冻存于2 0 备用。 4 S D S P A G E 电泳液 取一瓶可以配置1L 电泳液的粉剂，倒入一洁净烧杯中，加入蒸馏水到约 9 0 0 m l ，溶解。 在量筒中定容至l Jl L ，混匀后即可使用。一般可以重复使用3 - 4 次。 5 W e s t e r nb l o t 转膜液 取一瓶可以配f l ；f l 升W e s t e r n 转膜液的粉剂，倒入到一洁净的烧杯中，加入 蒸馏水到约7 0 0 毫升，溶解。 再加入2 0 0
10、毫升无水乙醇或2 1 0 毫升9 5 乙醇，混匀。 在量筒中用蒸馏水定容到l 升。混匀后即可使用。一般可重复使用3 4 次。 6 1 0 T B S 缓冲液 取“ I r i sb a s e2 4 2 9 ，N a C I8 0 9 ，用蒸馏水定容至1 1 0 0 0 m l ，用浓盐酸调整p H 值到7 6 。 7 1 T B S T 溶液 取1 0 X T B S 溶液1 0 0 m l ，加入1 0 0 T w e e n 一2 0l m l ，用蒸馏水定容至U 1 0 0 0 m l 。 8 封闭液与抗体稀释液 均为含7 5 脱脂奶粉的T B S T ：用4 0 m l T B S
11、T 溶解3 9 光明脱脂奶粉，使其 终浓度为7 5 ，即配即用。 9 显影定影液 按照说明配制，分装到干净的5 0 0 m l 棕色瓶里，密封4 。C 保存。 ( - - ) 人纤维连接蛋白预包被培养板 接种细胞前按培养板的底面积以1 0 0 t l e m 2 加已稀释的5 01 t g m lH F N 于培 养板，轻晃使H F N 在孔底分布均匀。 培养板子3 7 培养箱中静置2h 。 取出培养板，以微量移液器吸弃H F N ，即可将细胞悬液接种于培养板中。 ( 三) 人脐血单个核细胞的分离 志愿的健康足月顺产产妇分娩后即刻取其离体胎盘，以肝素为抗凝剂， 抽取脐静脉血4 0m l ，加入
12、等体积H a n k S 液稀释并混匀。 在1 5m l 离心管中加入3 7 预热的人淋巴细胞分离液，倾斜离心管，用毛 细吸管将稀释血液沿管壁小心加于淋巴细胞分离液上，使两者之间有一 清晰界面，人淋巴细胞分离液体积按所需加的稀释血液量计算，上下两 层的体积之比为3 ：2 。 置水平离心机中，室温下7 0 0 G 离心力离, t l , 3 0 m i n ，可以看到管内容物分为 四层，第一层为血浆；第二层为环状乳白色单核细胞层；第三层为透明 温州医学院硕士学位论文 分离液层；第四层为红细胞层。第二层内即为所需的单个核细胞( M N C s ) 。 用毛细吸管吸弃第一层，沿管壁吸取环状乳白色单核
13、细胞层，边吸取边 旋转离心管。吸取物移入另- - 1 5m l 无菌离心管。加入3 倍体积H a n k S 液， 混匀，1 0 0 0r p m 离一C , , 1 0m i n ，弃上清，重复洗涤两次。 加入4 m l 含1 0 胎牛血清、青霉素( 1 0 0U m 1 ) 及链霉素( 1 0 0U m 1 ) 的 E G M 2 培养液制成M N C s 悬液。 ( 四) 人脐血E O C s 的培养 将所得4 m l M N C s 悬液接种到预先包被H F N 的6 孔培养板的2 个孔中，每孔 2 m l 。 置3 7 、5 C 0 2 饱和湿度培养箱中培养。 培养2 4h 后，吸弃
14、培养液，以H a n k s 液轻柔吹打洗去未贴壁细胞及碎片， 更换全部培养液，贴壁细胞继续培养。之后前7d ，每2 4h 更换一半培养 液。7 d 后，每7 2h 更换全部培养液。 细胞长至7 0 8 0 汇合时按照1 1 0 5c e l l s 孑L 的密度于六孔板传代。 ( 五) 细胞的传代 吸弃培养液，用D H a n k S 液轻柔洗一次弃去。 加入0 0 5 胰酶( 1 0 0 9 l c m 2 ) ，放入3 7 。C 孵箱静置1 5 2 5 m i n 。 倒置相差显微镜下观察消化效果。 等待细胞基本变圆漂浮后加入等体积含1 0 F B S 的培养液中止消化，1 0 0 0
15、r p m 离，已, 5 m i n 收集细胞。 按照六孔板1 1 0 5 个孔的密度传代。传代后的细胞，镜下观察集落密度 到达所需要的程度时，用于细胞鉴定及研究。 ( 六) 细胞鉴定 1 、D i I a c - L D L 和F C U E A 一1 双荧光染色鉴定 细胞爬片：将第二代E O C s 用0 0 5 的胰酶消化，调整细胞密度为2 0 0 0 0 个 m l 左右。将高压灭菌的0 5 O 5c m 2 盖玻片置于6 孔培养板内，用移液器 取上述细胞悬液0 1m l 于盖玻片上，置培养箱中，待细胞贴壁( 大约2h 后) 后补充加入培养液，次日加入D i I a c - L D L
16、 使终浓度为1 0m g L 。 避光孵育4h 。 在避光条件下吸除培养液，以P B S 洗3 次。 用4 多聚甲醛固定细胞1 0m i n 。 用P B S 浸洗。 将F I T C U E A 一1 ( 1 0m g L ) N - 于I - _ 述标本于3 7 下孵育lh ，并始终保持避 光状态。 温州医学院硕士学位论文 P B S 洗3 次。 在激光扫描共聚焦显微镜下观察，D i I a c L D L 和F I T C - U E A 一1 双染色阳性 的细胞为正在分化的E O C s 。 以不J J I D i I a c L D L 和F I T C U E A 1 的同批培养E O C s 作空白对照。 以血管平滑肌细胞( A 1 0 ) 作为阴性对照。 随机选取5 个2 0 0 倍视野
