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1、j 7 9 3 2 7 1 学校代码：1 2 3 学号：2 0 0 2 0 1 0 9 3 1 、北京地区绝经后女性腹主动脉钙化与骨质 疏松的关系 A s s o c i a t i o nBe t w e e nA b d o m i n a lA o r t i c C a l c i f i c a t i o na n dO s t e o p o r o s i si n P O S t m e n O p a U S a lW O m e n l n 上；e 1 1l n g 、1T TT1 2 、2 5 羟维生素D 一1 优羟化酶( C Y P 2 7 B 1 ) 突 变基因的功
2、能研究 T h eF u n c t i o n a lS m d yo fM u t a t i o ni n 1 0 c - h y d r o x y l a s eg e n eC Y P 2 7 B1 姓名： 导师姓名： 导师组成员： 完成日期： 崔宁宜 北京协和医学院临床医学专业2 0 0 2 级 夏维波( 教授) 北京协和医学院临床学院 内分泌科 聂敏( 副研究员) 北京协和医院内分泌科 姜艳( 主治医师) 北京协和医院内分泌科 2 0 1 0 年6 月 目录 第一部分 中文摘要4 A B S T R A C T 6 前言9日U 舌9 技术路线1 1 研究对象和方法1 2 结果1
3、 6 l 、研究对象的一般资料1 6 2 、腹主动脉钙化的特点1 7 3 、腰椎B M D 、股骨颈B M D 和A A C 的共同相关因素1 8 4 、B M D 与A A C 的关系( 2 0 5 、A A C 和骨质疏松的关系2 2 6 、A A C 与骨质疏松性椎体骨折的关系2 6 7 、胱抑素C 与骨密度、血管钙化的关系2 8 8 、2 5 ( O H ) D 和A A C 、心血管疾病的关系3 0 讨论3 2 结论3 6 论文综述4 4 2 l 、研究对象的一般资料1 6 2 、腹主动脉钙化的特点1 7 3 、腰椎B 肋、股骨颈B 肋和从C 的共同相关因素1 8 4 、B 如与A
4、A C 的关系2 0 5 、从C 和骨质疏松的关系2 2 6 、从C 与骨质疏松性椎体骨折的关系2 6 7 、胱抑素C 与骨密度、血管钙化的关系2 8 8 、2 5 ( O H ) D 和从C 、心血管疾病的关系3 0 讨j 念3 2 结论3 6 论文综述4 4 4 6 9 l 2 6 1 上1 上1 工 中文摘要 北京地区绝经后女性腹主动脉钙化与骨质疏松的关系 目的： 探讨中国北京地区绝经后女性腹主动脉钙化和骨质疏松的关系。骨质疏松的评 估包括腰椎和股骨颈骨密度、椎体骨质疏松性骨折；腹主动脉钙化作为动脉粥样硬 化的标志物及心血管疾病的独立危险因素，通过线片评估。同时，考虑了年龄、 B M I
5、 、绝经年限、运动、生活方式、心血管危险因素等多种混杂因素的影响。 方法： 在北京地区随机抽取1 6 0 6 名绝经后女性作为研究对象，通过标准化问卷调查、 血生化指标测定确定骨质疏松及心血管危险因素，以双能X 线吸收法测定腰椎 ( L 2 4 ) 、股骨颈骨密度，通过胸腰椎X 线片诊断椎体骨折，并进行半定量的腹主 动脉钙化评分。采用l o g i s t i c 回归等统计学方法分析腹主动脉钙化和骨密度、椎体 骨折的关系。 结果： 1 ) 较低的股骨颈B M D 伴随较高的A A C 评分，在多分量l o 西s t i c 回归中，经过 年龄、绝经年限、B M I 、教育程度、运动情况、吸烟
6、、饮酒、血脂、胱抑素C 、高 血压、糖尿病、冠心病、心血管危险因素评分校正后，股骨颈B M D ( O R ：O 1 5 2 ， 9 5 C I ：0 0 3 3 0 7 0 2 ，P 7 8 咖o l 几者，评 为3 分； 2 、7 0 岁，评为2 分； 3 、6 5 7 0 岁之间，评为1 分； 4 、吸烟( 每天超过1 0 支，持续6 个月以上) 、高血压、高脂血症( L D L C 4 1 4 咖0 1 L ，或H D L C 2 8 2 衄o l L ，每种情况各评为1 分， 如三者都具备，则评4 分) 。 心血管疾病包括参与者自我报告的冠心病、卒中。 5 、骨密度的测量 骨密度(
7、B o n eM i n e m lD e l l s i t y ，B M D ) 由双能X 线吸收法( D u a lE n e 唱yX n l y A b s o 巾t i o m e 仃y ，D E X A ) 测定，具体部位为腰椎L 2 L 4 、左侧股骨近端股骨颈，单 位为c m 2 。为达到严格的质控要求，由放射科的专业医生负责，进行骨密度测定 的标准化培训。每同使用前用统一的体模对所有的骨密度测定仪进行准确度的验 证，以评价系统稳定性。本研究中腰椎B M D 的C V ( C o e 舔c i e mo f I r i a t i o n ，变异系 数) 为1 7 ，股骨颈C
8、V 为0 9 。其中，海淀医院和第二炮兵总医院使用N o r l a I l d 型双能X 线骨密度仪进行测定，其余中心使用L 吼a r 型双能X 线骨密度仪( D P X 或 P r o d i g y ) 进行测定，由于L u I l a r 仪器间测量值差别微小，而L 1 m a r 和N o r l a n d 仪器 测量值之间存在系统差别，因此以文献推荐公式对二者的骨密度值进行校正柏： 胰椎L 2 4B M D ( g c m 2 ) L u I l a r _ N o r l 船d 1 1 0 2 + O 0 13 7 股骨颈B M D ( g c m 2 ) L l l I 】a
9、 r = N o r l a n d 1 0 3 7 7 + O o 0 0 2 6 6 、骨质疏松的诊断标准 根据W H O 推荐的诊断标准，将骨质疏松定义为骨密度一2 5 S D ( T - s c o r e 2 5 ) ， 骨量减少定义为骨密度介于1 肛2 5 S D 之间( 2 5 9 0 的面积时可以对其进行传代，具体方法如下： 1 ) 由细胞培养箱中取出细胞培养瓶。 2 ) 小心去除陈旧的培养基。 3 ) 加入适当体积2 5 胰蛋白酶( 0 6 m 1 2 5 m 1 培养瓶，1 8 m 1 7 5 m 1 培养瓶) ，来回轻 轻晃动培养瓶，使胰酶充分与细胞接触，3 7 放置2
10、4 分钟。 4 ) 加入3 4 m 1 含血清的新鲜D M E M 培养基终止胰酶消化。 5 ) 使用长头吸管充分吹打贴壁细胞，动作要轻柔。 6 ) 将细胞悬液吸入无菌离心管中，室温，1 0 0 0 r p m ，离心5 分钟。 7 ) 小心弃上清，于离心管内加入新鲜培养液，吸管充分吹打使之成为细胞悬液。 8 ) 将细胞悬液滴于细胞计数板上，镜下计数，根据不同的目的选择适宜密度细胞接 种于培养瓶或培养板。 9 ) 置于C 0 2 培养箱培养。 2 32 9 3 T 人胚肾细胞的冻存 7 4 对2 9 3 T 细胞进行消化，操作同前，离心并弃上清，加入配置好4 预冷的细胞冻 存液，冻存液中细胞的
11、终浓度为5 1 0 1 0 5 m l ，分装在冻存管中( 每管1 5 m 1 ) ，用 棉布包裹，一7 0 过夜，次R 投入液氮罐中保存。 1 质粒瞬时转染操作步骤 本实验所采用的质粒转染方法为阳离子脂质体瞬时转染法，该方法转染效率 高，细胞毒性相对小，操作简便，适用于各种培养细胞，尤其是2 9 3 T 细胞，转染 效率基本可达9 0 以上。其原理是利用带正电荷的脂质体与核酸带负电的磷酸基团 形成复合物，然后脂质体上剩余的电荷与细胞膜上的唾液酸残基的负电荷结合，通 过内吞作用将质粒D N A 导入细胞内。 本实验采用I n v i t r o g e n 公司的1 i p o f e c t
12、 a m i n e2 0 0 0 转染试剂，具体方法如下： 1 ) 将2 9 3 T 细胞按照3 x1 0 5 孔的密度接种于六孔板，置于C 0 2 培养箱中培养，待细 胞汇合达8 0 左右( 培养时间约2 0 小时) ，将细胞培养孔内培养液更换为尢血清细 胞培养液( 不含抗牛素) ，于细胞培养箱内继续培养l 小时。 图4 阳离子脂质体法原理图 2 ) 根据之前的预实验结果，质粒D N A 量与转染试剂l i p o f e c t i a m i n e2 0 0 0 量的最佳 比例为4 u g ：8 u l 孔( 六孔板) ，每种质粒设3 个平行复孔，配置A 液与B 液： A 液：O P
13、 T I M E M2 5 0 u l + l i p o f e c t a m i I l e2 0 0 08 u l 混匀，室温放置5 分钟 B 液：O P T I M E M2 5 0 l l l + 质粒D N A 4 u g 轻弹混匀 3 ) 在B 液中缓慢滴加入A 液，小心混匀后，室温孵育2 0 分钟。 4 ) 六孔板细胞换无血清培养基孵育l 小时后，每孔小心加入上述混匀液体。 5 ) 放入C 0 2 培养箱中3 7 培养6 小时取出，更换含血清的新鲜D M E M 培养基，继续放 入c 0 。培养箱中培养1 8 小时待下一步反应。 3lQ 羟化酶的羟化反应方法 在用脂质体法向细
14、胞中转染C Y P 2 7 8 1 野生型及突变型基因3 6 小时后，更换新鲜 的含血清细胞培养液，然后向细胞培养孔中加入事先配置好的反应底物2 5 0 H D ( 浓 度为O 0 1 u 洲) ，每孔加入量为l u m 0 1 ，使其在培养孔内的终浓度为O 5 m m 0 1 L ，继 续放入C 0 ：培养箱中3 7 培养8 小时，收集细胞培养液，分装于E P 管，做好标记， 一2 0 冻存待下一步测定。 4 放射免疫法检测2 5 0 H D 和1 ，2 5 ( O H ) ：D 4 12 5 0 H D 的测定： 1 ) 准备标记好的1 2x7 5 哪硼酸硅玻璃管，标准品，待测细胞培养液标本，质 控等各一个； 2 ) 每管中加入5 0 0 u l 乙腈，注意每次加样都要确保加到管底； 3 ) 取5 0 u l 标准品，质控或待测标本，将枪头伸到乙腈液面以下，小心缓慢将样本 加入乙腈，涡旋混匀1 0
