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1、血清药理学在中药复方研究中的应用及其评价(一)【关键词】 血清药理学中药复方血药清药理学是目前国内外中药药理研究领域中的热门话题之一，它起始于1987年，日本Iwama等1发表了用动物含药血清研究中药的文章，并认为用该方法研究中药的在体作用是实用的体外实验系统。其最大的优点表现在实验结果与在体实验结果的一致性以及体外实验的易操作性，避免了在中药复方药理研究的体外实验中，将中药粗制剂直接加入体外反应体系中，而造成不能真实地反映体内药物作用情况的发生，是体外实验和体内反应相结合的一个较好的实现。但是作为一套科学规范的，可推广的血清药理学方法，还存在很多疑问诸如给药剂量、采血时间、血清灭活与否等问题
2、的争论。近年来，血清药理学不断被应用于中药药理研究中，甚至在西药的药理研究中也取得了较大的进展。笔者综合近年来国内研究情况，简述如下。1 血清药理学在中药研究中的应用就目前国内学者研究的实验结果来看，中药血清药理的研究主要在以下几个方面。1.1 中药粗制剂的直接作用和药物血清作用的比较 在中药复方药理研究的体外实验中，将中药粗制剂直接加入到体外反应系统中，在实验方法学上存在着许多问题，中药粗制剂的成分复杂，含有各种电解质或杂质成分，以及酸碱度的影响等，都会对其生理活性造成一定的影响，从而导致体内外实验结果的不一致。中药复方一般是经口服后，经胃肠道吸收代谢失活或未经吸收（如一些高分子化合物），以
3、及药物的非有效成分可能在胃肠道酶的作用下，转化成有效成分，或通过体内的其他系统间接产生作用。用含药血清来做体外实验，不仅可避免中药复方各种电解质和杂质的干扰，而且更接近体内的药物代谢，产生药效的情况。徐瑶等2采用Greiss试剂检测小柴胡汤醇提物及灌服小柴胡汤醇提物小鼠血清对小鼠巨噬细胞释放NO的影响，研究小柴胡汤的抗肝损害的机制。结果显示：小柴胡汤醇提物直接加入小鼠腹腔巨噬细胞培养液中不影响NO的产生，而加入120 min、180 min、240 min采集的含小柴胡汤醇提物小鼠血清能促进NO的产生，表明促进小鼠腹腔巨噬细胞NO的释放可能是小柴胡汤的抗肝损害机制之一。这个研究结果提示，用含有
4、药物成分的血清代替中药粗制剂进行试验更接近药物在体内环境中产生药效的真实过程。1.2 给药剂量及含药血清添加浓度的量效关系研究 血清药理学实验方法是以含药血清作为药源进行观察。体外实验系统中，不同的血药浓度产生不同的药理作用，即量效关系。王力倩等3在观察含苦参、仙鹤草的血清对肝癌腹水癌细胞体外生长的影响实验中，提出了血清供体的给药剂量参考公式为：给药剂量=临床常用量动物等效剂量系数（按体表面积）培养基内稀释度，结果表明，以参考公式计算的给药剂量，可以达到一定的血药浓度，具有抗肿瘤活性，而给予低于参考公式计算的剂量，则不能达到一定的血药浓度，对肿瘤细胞的体外生长无显著作用。詹红生等4用含药血清方
5、法观察补肾益精方对破骨细胞功能的影响，分别以补肾益精方等效剂量的0.5、1.0、2.5倍剂量，连续两次（间隔2 h）灌胃，于末次灌胃后1 h采血，各剂量组含药血清添加浓度（体积比）又分别为10%、20%、30%。结果显示，补肾益精方含药血清对破骨细胞骨吸收功能的抑制作用呈明显的剂量依赖关系，其中2.5倍剂量组的含药血清抑制作用最强，同时结果也显示每个剂量组有明显的含药血清浓度依赖关系，作用强度顺序为10%20%30%。说明增加给药剂量来提高药效是有限的，提高含药血清浓度更为合适。1.3 采血时间的确定及时效关系的研究 时效关系的研究最近也成了国内学者的研究热点，找出给药后采血的最佳时间，可以避
6、免药效物质被代谢减少或尚未吸收所造成的假阴性结果。目前中药血清药理学实验中常用的采血时间是60 min、90 min、120 min等，一般不超过360 min。詹红生等4观察不同时间采血对补肾益精方含药血清抑制破骨细胞功能的影响，以等效剂量连续两次（间隔2 h）灌胃，分别于末次灌胃后1 h、2 h、3 h采血，同等条件下制备生理盐水灌胃对照血清，结果表明，1 h的含药血清组的骨吸收陷窝数显著低于其他各组。方素萍等5研究黄连解毒汤含药血清对血管内皮细胞增殖及黏附中性粒细胞能力的影响的实验中，观察连续给药3天后0.5、1、1.5、2、2.5 h所取黄连解毒汤（HLJDT）含药血清对HUVEC增殖
7、及黏附中性粒细胞（PMN）能力的影响，结果显示各点的HLJDT含药血清均有一定的抑制HUVEC PMN黏附的作用，且与取血时间点存在一定的时效关系，其抑制细胞黏附的最佳时间点为90 min左右。1.4 给药方式的研究 为了使药物达到稳定的血药浓度，以便于药理作用的研究，这就要求在制备含药血清的过程中，必须有正确的给药方式，目前主要有710天给药法（每天给药1次，连续给药710天）；3次给药法（连续灌胃3次，第1、2次间隔20 h，第2、3次间隔4 h）；2次给药法（第1次给药后2 h后，再以相同剂量重复给药1次）。方素萍等5观察给药1次及连续给药3天后所取黄连解毒汤（HLJDT）含药血清对HU
8、VEC增殖及黏附中性粒细胞（PMN）能力的影响，发现连续给药3天组的含药血清抑制HUVEC PMN黏附的作用更强。刘成海等6在抗纤维化的中药复方血清药理学的研究中，发现一次给药抗正化瘀方各剂量、各时相组的药物血清对星状细胞增殖、中剂量各时相组药物血清对肝细胞均无明显作用，二次给药低中高剂量组1 h后的药物血清对星状细胞3HTDR掺入明显抑制，低中剂量组促进肝细胞3HTDR掺入。1.5 含药血清低温保存及灭活与否的研究 在中药复方的血清药理学研究中，往往需要制备大量的含药血清，这就涉及含药血清的保存问题，含药血清低温保存是否影响其药效，是保证实验结果可靠性的关键所在。周明眉等7以含头风饮（TFY
9、）血清抗血小板释放5-HT和阻滞内皮细胞钙通道作用为指标，探讨含药血清低温保存对其药效的影响。结果显示：含药血清经长时间低温保存后药效显著降低（P0.01），提示含药血清进行低温冰冻保存仍影响其药效，进行血清药理学实验以使用新鲜血清或保存时间较短的含药血清为宜。目前采集药物血清后，多经56 30 min灭活，但也有不经灭活而直接进行体外实验的。刘成海等6在研究抗肝纤维化的血清药理学实验中，将灭活的正常大鼠的含药血清作用于星状细胞，结果发现细胞内TDR掺入量较低。由此可看出，血清灭活后细胞增殖减弱，这可能与血清中细胞生成因子减少有关，这有助于减少血清的非药理性因素的干扰。但国内另外一些学者认为，
10、血清中含有的由机体产生的内源性有效成分以及中药中所具有的免疫活性多糖等一些有效成分会由于药物血清的灭活而造成减少或丧失，从而必然影响了实验结果。其次血清灭活后的情况与体内实验和临床用药也不相符，不能反映用药的真实过程。徐海波等8在探讨中药血清学方法一文中，提出了解决的方法，对于血清的非药理性干扰，可采用设空白对照组的方法来加以排除，而对于细胞培养中的微生物感染可用微孔滤除菌来防止。贺玉琢等9在研究灌服桂枝汤大鼠血清灭活前后对HSV-1致CPE的作用的实验中，设正常动物血清对照，以观察正常动物血清本身的作用，从而排除血清中存在的非药理性的因素。李仪奎10在探讨中药血清药理学实验的若干问题也提出了
11、血清在什么情况下需要预处理的问题，认为当空白血清出现显著阳性反应，严重干扰实验进行时，需要进行血清的预处理。但由于血清预处理后所带来的诸如以上提到的一些问题，故实验中究竟是否需要预处理，应视具体情况而定，不能一概论之。1.6 血清药理学在分析有效化学物质方面的应用 采用血清药理学的方法筛选药物，对含药血清进行化学分离，从血清中寻找有效成分，或通过含药血清作用与中药粗制剂直接作用的比较，分析其有效成分，有利于搞清中药在体内的有效活性物质，并且有利于从传统医药中筛选和开发新的药物。黄伟毅等11观察益气通络丹对小鼠平滑肌细胞（VSMC）的作用，结果发现益气通络丹含药血清中可能含有直接或间接可抑制VS
12、MC增殖的活性物质，该物质是益气通络丹经过复杂的体内代谢过程产生的。吴清和等12采用血清药理学方法研究了三黄乙肝胶囊对HBeAg的体外抑制作用。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）发现含三黄乙肝囊的家兔血清对HBeAg具有明显的抑制作用，并随着血清中药物浓度的升高、作用时间的延长而增强，而三黄乙肝胶囊粗制剂对HBeAg的直接抑制作用更强于含药血清，提示三黄乙肝胶囊中的有效成分可能未从胃肠道完全消化吸收或部分有效成分在体内代谢失活。Iwama等1应用血清药理学方法研究中药复方小柴胡汤的致有丝分裂作用，结果发现小柴胡汤煎剂浓缩液直接加到细胞培养基中有致有丝分裂作用，而用含小柴胡汤血清则无此作用，并分
13、析原因认为小柴胡汤致有丝分裂作用，可能由一些不能从胃肠道吸收的大分子物质产生，或因其有效成分经消化道或肝脏代谢失活所致。2 中药复方研究中对血清药理学的评价血清药理学的方法是中药复方研究中体外实验的一个新思路。开拓了中药药理研究的新领域。综合近几年来血清药理学在中药领域的应用，对中药血清药理学有如下几点评价：（1）含药血清与传统的中药粗提物直接加入法比较，更接近中药复方在体内的代谢过程，可以较好地反映中药的药效作用机制，能够在一定程度上揭示中药及其复方在胃肠内处置过程。（2）含药血清能更确切地评价和筛选有效药物或药物有效成分，是一种比较接近现实的中药药效评价和筛选系统。（3）血清药理学使现代科
14、学技术与传统医学有了一个切实可行的结合点，可以应用细胞和分子生物学手段来阐述药理机制，便于观察和追踪药物的吸收和代谢过程，有利于中药真正有效成分、有效活性部位的发现，为新药开发提供基础。（4）血清药理学的广泛应用推动了血清药化学、中药分析化学、中药及其复方药物动力学等新的中药药理学分支学科的发展，并且血清药理学与其相关学科的紧密结合，将有利于中药的研究深入到细胞和分子水平，促进了中药现代化。但是作为方法而言，同样存在着许多问题及局限性，国内学者关于这方面的研究文献到目前为止累计有近百篇，归纳起来大概有以下几点：（1）血清提供者的种属问题，应尽可能采用与细胞同一种属的动物来制备含药血清，由于不同
15、种属的肠道菌落群不同，有效成分的代谢等差异可能造成实验结果不同；（2）由于药物和观察指标的不同，必须在实验中首先进行量效和时效的研究，确定给药剂量、采血时间、血液添加浓度等制备含药血清的实验条件，若实验条件不同，会直接应影响实验结果的准确性；（3）含药血清的保存和灭活与否的问题，由于具体情况不同，有的实验需要对血清灭活，以排除非药理性的干扰因素，但在其他的一些实验中，血清的灭活以及低温保存都有可能导致血清中有效成分的丧失，从而影响了实验结果。（4）不是所有中药都通过血液起作用，也有不通过血液而起作用的，中药对消化道的直接作用，以及中药本身的四气五味所起的作用，难以在血液中实现，这方面血清药理学
16、是无能为力的；（5）由于中药药理学机制的多样性，任何一种单一元素在复方药效作用中是微效的，但这种微效作用可累积成较强的生物学效应，且由于各组分之间的相互作用，大多数组分是有效成分还是无效成分尚不能确定，就目前的技术手段，不具备分析复方血清中所有单一成分的能力，这限制了中药血清药理学在中药复方研究和新药开发中的应用范围。国内学者13认为，中药血清药理学尚处于探索阶段，许多方面仍需进一步的完善。中药血清药理学目前存在的许多问题，需要不断地加强研讨，以及依赖于相关学科的发展。但其本身所具有的优势已经使之处于不可取代的位置。笔者相信，随着今后的大量的系统的研究，以及其他一些相关学科的发展和支持，在方法学上不断规范和完善，建立一个中药血清药理学研究的方法体系。这必将有助于促进中药现代化的研究，有助于促进中药走向世界。【参考文献】1 Iwama H,Amagaya S, Ogihain Y.Effect of shosaikoto,a Japanese
