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1、河北医科大学 硕士学位论文 紫草有效成分抗癌应用的探索及其分子机制的研究 姓名：韩春兰 申请学位级别：硕士 专业：药理学 指导教师：李灵芝;曾锦章 20100301 中 文 摘 要 中 文 摘 要 1 紫草有效成分抗癌应用的探索及其分子机制的研究紫草有效成分抗癌应用的探索及其分子机制的研究 摘摘 要要 目的：目的：紫草是我国传统中药，具有清热，解毒的功效。千百年来被用 于治疗斑疹，麻疹，咽喉痛，痈以及烧伤。近期内有临床研究表明紫草对 于治疗癌症特别是肝癌和肺癌具有较好的效果， 本文的目的即是研究紫草 有效成分抗癌作用的分子机制。 方法：方法：本课题为研究紫草及其衍生物对癌细胞抑制作用的分子机制
2、， 在药理学作用观察方面采用 MTT 作用于活细胞中的呼吸链，表征药物对 细胞增殖的影响，来考查其对癌细胞的的生长抑制作用。同时用 DAPI 对细胞核进行染色， 观察药物作用下癌细胞的细胞核是否呈现染色质边缘 化，出现凋亡小体，核固缩等凋亡形态。为进一步研究靶标药物促进癌细 胞凋亡的分子机制，采用 Ligand Binding 分析其与 RXR 蛋白的配体 9-cis 的竞争性亲和效应， 3H 标记的 9-cis 在闪烁液中的 cpm 值可以量化紫草中 竞争性结合 RXR 蛋白成分的结合能力。 另外 Western Blotting 的方法研究 不同浓度软紫草提取物处理后对癌细胞 RXR 蛋白
3、稳定性的影响。为选出 一个具有代表性的紫草成分及其衍生物，再次采用 MTT assay 的方法对 紫草提取物中的主要成分及其衍生物在不同浓度下对肺癌细胞H460的增 殖抑制情况，比较其生长抑制曲线，选择了效果最为明显的 SK02 作为我 们进一步研究的单组分药物， 来进行更多的相关实验研究。 实验中我们通 过转染 RXR 表达载体进 CV-1 细胞， 筛选得到的一个稳定高表达 RXR 蛋 白的细胞系，通过在该细胞系上进行 MTT 检测来研究药物对细胞的生长 抑制作用与RXR蛋白的关系。 同样用 3H 标记的9-cis确认了SK02与RXR 的结合能力后， 还采用糜蛋白酶酶切被 SK02 处理前
4、后的重组 RXR-LBD， 观察其 LBD 区域是否会因为其结合而发生构型变化， 表现在 Western Blot 上条带的变化。 为进一步研究药物的作用机制， 我们采用氯霉素乙酰转移 酶报告基因分析（CAT assay）考查靶标药物对 RXR 蛋白的同源转录激活 以及和 TR3，RAR 的异源转录激活作用：同时用 RXR 的表达载体和含 RXR 结合位点的 CAT 报告基因(TREpal)转染 CV1 细胞，转染后分别用 不同浓度的 SK02 和 RXR 的特异性配体 SR11237 处理 24 小时，CAT 分 中 文 摘 要 中 文 摘 要 2 析检测 RXR 的转录效率； 同样的在异源
5、转录活性检测中， 同时用 RXR 的表达载体, 表达 RAR 或者 TR3 的载体。 和含 RXR结合位点的 CAT 报 告基因(TREpal)转染 CV1 细胞，3H 标记的氯霉素乙酰转移酶的转录产物 的 cpm 除以考查转染效率的 -gal 值，即是药物影响下的转录效率。 结果：结果：我们发现 1 紫草粗提物能有效抑制肺癌细胞 H460 的生长，而 同时加入 9-cis-RA（RXR 的天然配体）减弱了这种生长抑制作用；2 配体 亲和实验表明紫草粗提物中含有可与 RXR 结合的成分，在 1 ug/ml 的浓 度下就能把半数结合上去的3H 9-cis-RA 竞争下来；3 经过不同浓度的紫 草
6、粗提物处理，H460 中 RXR 的含量出现剂量依赖性的下降，说明其对 细胞中 RXR 蛋白稳定性的影响；4 进一步研究紫草中作用的主要成分之 一 SK02 组分， 发现其对稳定高表达 RXR 蛋白的 CV-1 细胞系具有更强的 抑制作用；5 SK02 其能与 9-cis 竞争性结合 RXR，在 10-6M10-4M 间结 合能力逐渐增强，小于 10-6M 结合能力进入平台期；6 SK02 与 RXR 的结 合引起 RXR LBD 结构域的变化，使得其对糜蛋白酶的敏感性增强；7 SK02 亦能抑制 RXR 的同源二聚体转录激活， 以及与 RXR/TR3,RXR/RAR 的异源二聚体转录激活作用
7、；8 SK02 亦能促进 RXR 的降解。 结论：结论：紫草的抗癌作用是通过其活性成分与核受体 RXR 蛋白结合， 抑制 RXR 的转录激活并促进 RXR 蛋白的降解来实现的。 关键词：关键词：紫草；紫草素；RXR；肺癌 英 文 摘 要 英 文 摘 要 3 Anticancer application of Zicao active ingredients and the mo- lecular mechanisim ABSTRACT Objective：As Zicao is a commonly used herbal medicine in China, It is believed t
8、o hold capabilities of removing heat from the blood and detoxification, and it has been used for thousands of years for the treatment of macular erup- tions, measles, sore-throat, carbuncles and burns. Some clinical research indi- cates that Zicao is prominent candidate as anticancer drug, especiall
9、y for liver cancer and lung cancer, we lauch the project to investigate the mechanisms of its anticancer effects with molecular biological approches. Methods： We screened a series of drugs from shikonin and its derivatives that obviously inhibit the proliferation of tumor cell lines by MTT assay, as
10、 MTT reactes with the respiratory chain in living cell, which could be utilized in counting living cell rates under spectrophotometer. The cells treated with Zicao and its derivatives are also stained by DAPI to obseve the nuclei phe- notype under apoptosis. And then we compare their abilities bindi
11、ng RXR by Ligand Binding assay, while 9-cis with 3H tag plays as their competitors, which helps us demonstrate their binding abilities by radioation unit cpm. We employed Western blot assay to make a research on RXR stability under treatment of shikonin and its derivatives. We established a cell lin
12、e express high-level RXR by trancripting RXR-express plasmid into CV-1, to investi- gate the correlation of RXR and Zicaos inhibition of cell proliferation. To confirm if the fold form of RXR ligand binding domain transform after bind- ing with SK02, we lauched Trypsin zymography and compare their s
13、ensitivi- ties to Trypsin. For further study of their effects on RXR modulation process, we utilized CAT assay to observe their effects on RXR homologous and RXR/RAR, RXR/TR3 heterogenous transactivation. We co-transcripted RXR expression plasmid, CAT reporter vector containing TREpal，and then treat
14、ed with different concertrations of SK02 and SR11237 for 24 hours, 英 文 摘 要 英 文 摘 要 4 which is a ligand of RXR, when study its effects on homologous transactiva- tion. While co-transcripted RXR expression plasmid, TR3 or RAR expres- sion plasmid and CAT reporter vector containing TREpal in study of i
15、ts effects on heterogenous transactivation. And the the amount of chloramphenicol ace- tyltransferase with 3H tag can be measured by Scintillation Counter in the unit of cpm. Results：We found 1 Zicao can inhibit lung cancer cell line H460, while co-treat with 9-cis-RA , its inhibition effect was all
16、eviated; 2 Ligand binding assay indicated crude zicao extract can bind with RXR, and separates half of 3H 9-cis-RA binding with RXR when Zicao is at the concertration of 1g/ml ; 3 RXR protein degrades in H460 when treated with Zicao, indicating Zicao impares RXR stability; 4 More data on various active ingredients of Zicao demonstrate that many shikonin derivates, such as sk02, can bind with RXR and down regulate its both homologous and heterogenous transactivation; 5 SK02 repr
