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1、南京师范大学 硕士学位论文 粟酒裂殖酵母中Programmed Cell Death 2_C蛋白功能的研究 姓名：赵威 申请学位级别：硕士 专业：微生物学 指导教师：黄鹰 20100519 摘要A b s t r a c t 摘要 舢舢幽舢舢M J J J f 册删 Y17 , , 2 , , , J lp6fi , , i 6 l l l l 10l r l l I,2II I I I 。 背景：凋亡是有机体在漫长的进化过程中发展起来的细胞自杀机制，在清除 无用的、多余的或癌变的细胞，维持机体内环境稳态方面发挥重要作用。最早对 P r o g r a m m e DC e l lD e a
2、t hp r o t e i n2 ( P D C D 2 ) 研究发现该蛋白可能参与细胞凋亡。 但随着对其研究的深入，发现该蛋白似乎与细胞凋亡无关，但是和细胞的发育， 细胞周期以及某些疾病有一定的联系。P D C D 2 蛋白具有一个重要的功能结构域 一P D C D 2 _ C 结构域。将带有P D C D 2 一C 结构域的蛋白都归为P D C D 2 _ C 蛋白。调查发 现P D C D 2 一C 蛋白似乎只存在真核生物细胞中。并且这类蛋白由看家基因编码，在 人和小鼠各个组织都有表达。在裂殖酵母中存在两个P D C D 2 一C 蛋白： S P A C l 3 G 6 0 9 ，P
3、D C D 2 的同源蛋白本文中命名为p o d l ；S P B C 2 5 H 2 1 5 ，芽殖酵母 P D C D 2 一C 蛋白( 硒膨) 的同源蛋白本文中命名为p C d 2 0 这两个蛋白在裂殖酵母中 的功能还未有报道，本文主要探究这两个P D C D 2 蛋白的功能。_C 实验和结论：1 首先用同源重组和随机孢子分析法，证明了裂殖酵母中p c d l 为必需基因，p c 以为非必需基因。这提示这两个P D C D 2 一C 蛋白在裂殖酵母中的 功能可能不同。接着用高表达和低表达的p c d l 的质粒，都能救活因敲除p c d l 致 死的单倍体。直接敲除裂殖酵母单倍体p c
4、d 2 , 敲除菌株能正常生长。这两个实 验都再次证明p c d l 为必需基因，p c 以为非必需基因。 2 用高表达和低表达N 端带2 个F L A G 标签p c 棚的质粒都能救活敲除p c 以的 单倍体。但是用高表达的人P D C D 2 、芽殖酵母T S R 4 , N 端为p c 棚，C 端为人P D C D 2 蛋白P D C D 2 一C 结构域的融合蛋白、裂殖酵母p c d 2 和C 端带5 个F L A G 标签p c d l 的质粒都不能救活敲除了p c d l 的单倍体。这些实验提示：N 端2 个F L A G 标签对 p c d l 的定位和功能没有太大影响；人和芽殖
5、酵母的P D C D 2 一C 蛋白与裂殖酵母p c d l 功能不同，也有可能在裂殖酵母中p c d l 还有其他必需功能；人P D C D 2 _ C 结构域 也不能替代裂殖酵母P D C D 2 C 结构域，可能因为人P D C D 2C 结构域替代裂殖酵母 的结构域后整个蛋白的空间结构遭到破坏，导致蛋白功能丧失；p c d l 和p c d 2 功 能不同；C 端的5 个F L A G 能破坏p o d l 的空间结构导致蛋白功能丧失或者5 个F L A G 阻碍了p c 棚与其相互作用蛋白的结合。 3 敲除p c d 2 的单倍体在面对逆境压力时，生长状态和野生型几乎一致。这表 示p
6、 c d 2 在裂殖酵母的应对逆境过程中没有必需的作用。 4 利用酵母双杂交系统中的筛选，与p c d l 和p c d 2 相互作用的蛋白。发现m o e l 和4 0 S 蛋白r p s 2 6 0 2 片段可能和p c d l 相互作用。而S P A C l 0 9 3 0 5 ( A T P d e p e n d e n t R N Ah e l i c a s eH c a 4 ) 的片段可能与p c d 2 相互作用。但是验证上述蛋白全长是否 摘要A b s t r a c t 和p c d l 和p c d 2 相互作用时，都未能检测出相互作用。利用该系统仍未检测了 p c d
7、 l 和S P A C l 0 0 2 1 4 ( 裂殖酵母中泛素化连接酶Z 3 ) 相互作用。 5 双敲除p c d 2 和g c n 5 的单倍体不能存活。但是双敲除p c d 2 和s t y l 后单倍 体生长和敲除p c d 2 的单倍体生长状态几乎一致二这提示p c d 2 和g c n 5 有可能存 在一定的联系，或者共同参与了某种信号传导途径；而s t # 可能不是p c d 2 的磷 酸酶。 关镁t i r , q 粟酒裂殖酵母，P D C D 2 一C 蛋白，功能研究 摘要A b s t r a c t 一一一 A b s t r a c t B a c k g l r o
8、 u n d ：A p o p t o s i si sa l la u t os u i c i d em e c h a n i s mt h a tc a l lc l e a nt h eu s e l e s s ， p l u s ，c a r c i n o m a t o u s c e l l st ok e e p 也eo r g a n i s m sb a l a n c e 。A tt h ee a r l y s ts t a g e , I P r o g r a m m e D C e l lD e a t hp r o t e i n2 ( P D C D 2
9、 ) w a sr e p o r t i n v o l v e di nt h e a p , o p t o s i s H o w e v e r , t h e r ea l e m o r ea n dm o r ed a t at os h o wt h a tt h i sp r o t e i ns e e m sn o t h a y ec o n n e c tw i t ha p o p t o s i sb u tt h ed e v e l o p e m e n ta n dt h ec y c l eo fc e l l W h a tm o r e ， t h
10、 em u t a n t so ft h i sp r o t e i ni ss e e m sf o rt h ec a u s eo fs o m ed e s e a s e s P D C D 2o w n so n e i m p o r t a n td o m a i nf o r i t sf u n c a t i o n - P D C D 2 _ Cd o m i a n T h i ss t u d ys o r ta l lt h ep r o t e i n s w 1 1 i c hl 刖et h i sd o m a i nt ot h eP D C D 2
11、 一Cp r o t e i n W eC a no n l y f r e dP D C D 2 一C p r o t e i ni ne u k a l y o t i co r g a n i s m T h i sg e n ei sl i k et ob ea h o u s e k e e p i n gg e n e ，b e c u s e i t sp r o t e i nC a nb ef r e di ne v e r yt i s s u eo fh u m a na n dm o u s e T h e r ea r et w oP D C D 2 一C p r o
12、 t e i n si nS c h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b e ：S P A C l 3 G 6 0 9 ，t h eh u m a n P D C D 2 o r t h o l o g ， n a m e dp c d li nt h i ss t u d y ；S P B C 2 5 H 2 15 ，S a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eT S R 4o r t h o l o g , n a m e d p c d 2 i nt h i ss t u d y T h ef u n
13、 c t i o no ft h e s ep r o t e i n sc a i l tb ef i n d , ，S Ot h i ss t u d yt r y t oe x p l o r et h e i rf u n c t i o n T e s I s & C o n c l u s i o n ：1 W ec e r t i f i c a t et h a tp c d li sae s s e n t i a lp r o t e i na n dp c d 2i s n o n e s s e n t i a lb yt h em e a n so fh o m o
14、l o g o u sr e c o m b i n a t i o n k n o c k o u ta n da n d t e a b a n t - s p o r ea n a l y s i s W er e s c u et h ep c d l As t a i nw i t ht h eM 曲a n dl o we x p r e s s i o no f p c d is u c c e s s f u l l y , a n dt h ek n o c k o u to f p c d 2 i nh a p l o i d , 。f i s s i o ny e a s
15、tC a ns t i l ll i v ea s n o r m a l l y T w oo ft h ea b o v e t e s t sc a np r o v et h ec o n c l u s i o na g a i n 2 B o t ho ft h eh i 曲a n dl o we x p r e s s i o no f p c d lw i t ht w of l a gi ni t sN t e r m i n a lC a n r e s c u et h eh a p l o i dw i t h o u tp c d l T h eP D C D 2 (
16、 h t t m a n ) ：，T S R 4 ( P D C D 2 _ Cp r o t e i n i n b u d d i n gy e a s t ) ，f i s s i o np r o t e i n ( Nt e r m i n a lo fp c d la n dC t e r m i n a lo fP D C D 2 ) ，p c d 2 a n d 口c d f i s s i o nw i t h5f l a gi nCe n d i n g I Sh i g he x p r e s s i o nC a n ts a v et h eh a p l o i d w i t h o u tp c d l T h ea b o v et e s t ss h o wt h a t ：t h e2f l a g a tt h eNt e r m i
