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1、中国医科大学 博士学位论文 游离脂肪酸致胰岛素抵抗的作用机制 姓名：张静 申请学位级别：博士 专业：内科学 指导教师：刘国良 20040301 中文摘要 目的 胰岛素抵抗是指一定量的胰岛素与其特异性受体结合后生物效应低于 正常，表现为外周组织尤其是肌肉、脂肪组织对葡萄糖摄取减少及抑制肝葡 萄糖输出的作用减弱，临床上表达出糖代谢紊乱、肥胖、血脂异常等多代谢 失调。胰岛素抵抗是2 型糖尿病发病的基础。肥胖是2 型糖尿病的重要危 险因素，肥胖和2 型糖尿病患者中普遍存在着胰岛素抵抗。近年发现肥胖 症和2 型糖尿病患者体内游离脂肪酸( “ef a t t ya c i d ，F F A ) 的升高在胰
2、岛 素抵抗的发生过程中起了重要作用。 胰岛素的主要生理作用是调节靶组织对葡萄糖的利用，维持体内糖代 谢的平衡，而其生物学效应的实现依赖于胰岛素信号传导通路。胰岛素的 代谢效应主要与胰岛素信号传导的磷脂酰肌醇一3 激酶( p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 一3k i n a s e ，P I - 3 K ) 途径有关，胰岛素与靶细胞表面的胰岛素受体( I R ) d 亚单位结合，使I R 的B 亚单位自身磷酸化和激活其内在的酪氨酸激酶，导 致胰岛素受体底物( I l L S ) 的酪氨酸残基磷酸化，磷酸化的I R S 与P I - 3 K 的 p 8
3、 5 调节亚单位结合，解除p 8 5 调节亚单位对P I - 3 K 的p 1 1 0 催化亚单位的 抑制而激活P I - 3 K ，进而使蛋白激酶B ( p r o t e i nk i n a $ eB ，P K B ) 磷酸化而激 活。P K B 为P I - 3 K 通路中的关键分子，它能够作用于糖原合酶激酶一3 ( G S K 一3 ) 、葡萄糖转运子( G L U T ) 、p ”S 6 激酶( p 7 0 S 6 K ) 等多种底物，可介导 产生多种生物学效应，如糖原合成、蛋白合成、葡萄糖转运、抑制细胞凋亡 等。在实现胰岛素生物学效应过程，胰岛素信号转导的多个环节受到信号 蛋白的
4、反馈调控和制约，处于下游的多种丝( 苏) 氨酸激酶，对胰岛素信号 转导起负性反馈调节作用；同时，下游的丝( 苏) 氨酸激酶，主要是P K B ，能 够维持I R S 的活化构象，可对信号系统起正性反馈作用。信号转导系统的 某些环节如受到阻碍，级联反应失去平衡，则出现不同程度的生物学效应降 低，即胰岛索抵抗。 葡萄糖进入细胞不是单纯扩散的过程，而是由蛋白质载体一G L U T 的 介导从而易化葡萄糖穿过细胞膜进入细胞内，这一过程是葡萄糖代谢中的 限速步骤。葡萄糖转运子4 ( G L U T 4 ) 是现已发现的十余种G L U T 中的重要 一员，仅存在于胰岛素敏感的骨骼肌、心肌和脂肪细胞中，胰
5、岛素刺激后 G L U T 4 由细胞内的贮存囊泡中转位至细胞外膜，且活性增加，与葡萄糖结 合并发生结构改变，将葡萄糖转运至细胞内后恢复原来结构。由此胰岛索 敏感组织可迅速对循环胰岛素水平作出反应，保持血糖平衡。因此G L U T 4 的表达在蛋白水平和基因水平都得到严密的调控，而能够影响其表达及转 位的因素则可能导致葡萄糖跨膜转运的异常，从而导致胰岛素抵抗。 由于F F A 升高对不同的靶组织产生的影响不同，因而离体实验是研究 F F A 对不同组织影响的作用机制的很好的工具。脂肪组织是胰岛素的重要 靶组织，近年发现它不但能储存能量，还是内分泌器官，能分泌产生瘦素 ( L e ：p t i
6、n ) 、抵抗素( R e s i s t i n ) 、核转录因子P P A R y 、肿瘤坏死因子一仳( T N F a ) 等多种激素和细胞因子，与肥胖和2 型糖尿病密切联系，在胰岛素抵抗 的发病机制的研究中有重要的地位。 胰岛素抵抗的病理机制的研究需要可靠的体外模型。3 T 3 一L I 细胞株 是国外应用较广泛的重要细胞模型，在一定的体外培养条件下能够由成纤 维细胞分化为成熟脂肪细胞，对胰岛素的刺激敏感，主要用于胰岛素刺激的 葡萄糖摄取和代谢的信号传导机制及降糖药物作用机制的研究；而国内有 关3 T 3 L 1 细胞的研究报道还为数不多。 骨髓问充质干细胞( m e s e n c
7、h y m a ls t e mc e H s ，M S C ) 来自于骨髓基质，又 称为“骨髓基质细胞”( b o n em a r r o ws t r o m Mc e i l s ，B M S C ) ，对骨髓造血干细 胞起支持诱导作用。在不同的诱导条件下，M S C 具有向中胚层组织细胞分 化的能力，如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞等分化的能 力。 本研究利用3 3 3 一L 1 细胞体外诱导分化为脂肪细胞；同时用密度梯度离 心和贴壁培养方法对大鼠M S C 进行分离培养和表面抗原鉴定，建立体外定 向诱导M S C 分化为脂肪细胞的方法；并对这两种通过体外定向诱导分化来
8、 得到大量成熟脂肪细胞的方法加以比较，探索以脂肪细胞为模型研究其在 内分泌系统的作用的新途径。本研究还选择了有代表性的F F A 一软脂酸 ( p a l m i t i ca c i d ，P A ) 和油酸( o l c i ca c i d ，O A ) ，观察不同种类和浓度的F F A 对 3 T 3 - L I 脂肪细胞葡萄糖摄取及胰岛素敏感性的影响，建立F F A 诱导的胰岛 素抵抗的细胞模型；并进一步观察F F A 对胰岛素信号转导通路中的关键蛋 白H - 3 K 和P K B 的蛋白表达和P K B 磷酸化水平( P P K B ) 的影响、F F A 对 2 G L U T
9、4 基因表达、蛋白表达及转位的影响。 方法 1 3 T 3 一L 1 细胞的培养及诱导分化 小鼠3 I “ 3 L 1 细胞在含1 0 小牛血清、1 0 0 U m l 青霉素和1 0 0 v , g m l 链 霉素的D M E M 培养液中，在3 7 。C 、5 C 0 2 、饱和湿度条件下常规培养。钿 胞汇合达9 0 以上后，开始进行诱导分化。无血清D M E M 培养液孵育2 小 时后，加入含1p L m o l L 的地塞米松、0 5 m m o l L 的I B M X 、1 斗g m l 的胰岛素、 1 0 F B S 的D M E M ( 诱导培养液1 ) 诱导4 8 h ，含
10、1 斗g r n l 的胰岛素、1 0 F B S 的D M E M ( 诱导培养液2 ) 处理4 8 h ，之后改为含1 0 F B S 的D M E M ( 维持培养液) 每4 8 h 换液，直到9 5 以上的细胞都分化为成熟的脂肪细 胞。 2 大鼠M S C 的体外培养和定向诱导分化为脂肪细胞 2 1 大鼠M S C 的分离纯化、原代和传代培养 将s D 大鼠无菌条件下取胫骨和股骨，将其两端干骺端切除，显露骨髓 腔，用含1 0 F B S 的D M E M 培养液彻底冲洗骨髓腔，冲出的骨髓制成单细 胞悬液。将骨髓细胞悬液沿离心管壁缓慢叠加到等体积淋巴细胞分离液 上，2 0 0 0 r p
11、 m 离心2 5 m i n 。小心吸取单个核细胞的界面层，至另一离心管，加 入含1 0 F B S 、1 0 0 U m l 青霉素、1 0 0 “g m l 链霉素的D M E M ，在3 7 、5 C O ：、饱和湿度条件下常规培养。 2 2 大鼠M S C 的表面抗原鉴定 取出细胞生长近满层的盖玻片，l O 福尔马林一钙固定1 0 1 5 r a i n ； 0 6 过氧化氢5 1 0 m i n 封闭内源性过氧化物酶；正常山羊血清封闭 2 0 m i n ；加1 ：1 0 0 稀释的一抗( 兔抗大鼠C D 4 4 、C D 5 4 、C D l 0 6 ) ，3 7 孵育 l i t
12、 ；J l 生物素化山羊抗兔二抗3 7 。C 孵育2 0 r a i n ；滴加试剂S A B C ，D A B 显色； 苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。 2 3 定向诱导大鼠M S C 向脂肪细胞分化 传至第3 - 7 代的M S C 血清饥饿2 h ，加入诱导培养液1 诱导4 8 h ；诱导 培养液2 处理4 8 h ；循环3 次，共1 2 天。 3 特异性脂肪细胞染色鉴定 取细胞爬片用P B S 充分洗涤，1 0 福尔马林一钙固定1 0 1 5 r a i n 。6 0 3 异丙醇媒染，油红O 室温染色3 0 r a i n ，7 0 酒精分色，蒸馏水洗，淡苏木素 ( 常用液1 ：5
13、稀释) 复染核，流水充分漂洗返蓝，甘油明胶封片。 4 F F A 处理脂肪细胞 蛋白吸附方法配制F F A 溶液，取诱导分化成熟的3 T 3 - L 1 脂肪细胞，加 入含不同终浓度F F A 的维持培养液，P A 组0 2 5 r a m 分别孵育6 h 、1 2 h 、2 4 h ， 0 5 r a m 孵育2 4 h ；O A 组同上；对照组不加任何干预因素。 5 。H D G 葡萄糖摄取的测定 取F F A 处理后的3 T 3 - L 1 脂肪细胞，按1 07 个细胞m l 的密度加5 0 一细 胞悬液到各反应试管中。每样品制备4 个反应管，分别测定基础状态( 无 胰岛素刺激，加不加细
14、胞松弛素B ) 和胰岛素刺激下( 加不加细胞松弛素 B ) 的细胞对葡萄糖的摄取。向试管中加入含0 1 B S A 的K R H B ( 稀释胰 岛素的溶剂，作为胰岛素的对照) 或2 0 0n M 胰岛素各5 0 t d ；同时为测定细 胞表面或细胞间隙中葡萄糖非特异转运，另加细胞松弛素B ( 结合到葡萄糖 转运子的葡萄糖转运抑制剂) 2 肛1 ，对照管加1 0 乙醇2 止；加入4 1 - L C i m l 的3 H D G S 0 一，使反应体系总放射量为0 2 斗C i ，总体积为1 5 2 一，3 7 0 C 摇动 水浴1 5 r a i n 后加入预冷的K R H B 终止反应。将试
15、管用预冷的K R H B 洗涤 一离心一吸去上清液，重复三次；加入裂解液0 1 S D S0 2 r a l ，加入1 2 m l 闪烁液，用液闪计数仪计数其每分钟衰变值( c p m ) 。 6 细胞收集和蛋白提取 向F F A 处理后的细胞和对照组细胞中加入胰岛素使终浓度为1 0 0 n M ， 3 7 。C 孵育1 5 r a i n 。细胞收集在离心管中，1 0 0 0 r p m 离心去上清，再以冷P B S 洗三次，加入粉碎缓冲液冰浴中超声粉碎，4 。C 过夜，1 2 0 0 0 9 离心3 0 m i n ，取 上清，酚试剂法定蛋白。 7 免疫蛋白印迹杂交( W e s t e
16、r nb l o t ) 蛋白样品加入样品缓冲液，沸水浴中煮5 r a i n 变性，S D S P A G E 电泳分 离，转印到P V D F 膜上，T r B S 洗膜3 次，每次5 r a i n ；浸入含5 去脂奶粉的 I T B S 封闭液中封闭1 5 h ，分别加入适当稀释的抗P I - 3 Kp 8 5 c t 、抗P K B o L 、 抗P P K B ( S e r 4 7 3 ) 、抗G L U T 4 多克隆抗体的一抗孵育4 过夜；取出 P V D F 膜，加入相应二抗室温摇床上杂交2 h 。N B T B C I P 显色，自动电泳凝 胶成像分析仪上采集图像，并对杂交带整合灰度值I n t e g r a t e dD e n s i t yv a l u e ( I D V ) 进行测定和结果分析。 8 半定量R T - P C R 检测G L U T 4 m R N A 的相对含量 五
