毒蕈碱胆碱受体3在小细胞肺癌中的表达及意义

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1、中山大学 博士学位论文 毒蕈碱胆碱受体3在小细胞肺癌中的表达及意义 姓名：张淑香 申请学位级别：博士 专业：内科学 指导教师：谢灿茂 20100520 中山大学博斗：学位论文毒蕈碱_ | I ! 碱受体3 在小细胞肺癌中的表达及意义 毒蕈碱胆碱受体3 在小细胞肺癌中的表达及意义 研究生：张淑香 专业：内科学 导师：谢灿茂教授 中山大学附属第一医院呼吸内科( 广州5 1 0 0 8 0 ) 中文摘要 肺癌是一种最常见的恶性肿瘤，其中，小细胞肺癌( s m a l lc e l ll u n gc a n c e r , S C L C ) 占原发肺癌的1 5 2 5 ，其倍增时间短、生长快，很早

2、就发生全身转移。 9 0 的S C L C 患者首选放疗和化疗。虽然对放、化疗敏感，但S C L C 是近3 0 年 来所有治疗敏感的肿瘤中最容易复发、预后最差的一种。有鉴于此，在放、化疗 的基础上，寻找更有效的药物作为一种辅助治疗手段对S C L C 的治疗有重要意 义。 近年来，非神经元性胆碱能信号通路与肿瘤的关系受到广泛关注。发现肿瘤 细胞能够自分泌或旁分泌乙酰月H 碱( a c e t y l c h o l i n e ，A c h ) ，作用于自身或邻近细胞 上的烟碱型胆碱受体( n i c o t i n i cc h o l i n e r g i cr e c e p t o

3、 r s ，N R s ) 和毒蕈碱型胆碱受体 ( m u s c a r i n i cc h o l i n e r g i cr e c e p t o r s ，M R s ) ，调节肿瘤的生长、转移等。M R s 有5 个亚型( M 1 R M 5 R ) ，研究发现在乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤、前列腺癌等都 有M R s 的表达，而且M 凡拮抗剂能够抑制肿瘤细胞增殖、血管发生、细胞迁移 并增加凋亡等，其中尤以M 3 R 为重要。但有关M 3 R 和S C L C 的研究报道不多， M 3 R 在S C L C 细胞增殖中作用的研究结果还不一致，M 3 R 在S C L C 其他方面如

4、 肿瘤细胞黏附、迁移及侵袭中的作用尚未见报道。 M 3 R 拮抗剂在临床上治疗慢性阻塞性肺疾病( c h r o n i co b s t r u c t i v ep u l m o n a r y d i s e a s e ，C O P D ) 已经很长时间，具有很好的安全性和疗效。如果在体外证实了 S C L C 细胞株表达M 3 R 且M 3 R 拮抗剂能够抑匍J S C L C 细胞增殖、迁移、侵袭和黏 中山大学博士学位论文毒草碱胆碱受体3 在小细胞肺癌中的表运及意义 附等，将为进一步研究M 3 R 拮抗剂作为S C L C 辅助治疗的种手段提供试验和理 论依据，也许能够为S C

5、L C 尤其是同时合并C O P D 患者的治疗带来新的希望。基 于上述考虑，我们做了如下的研究。 第一章体外人小细胞肺癌细胞株的培养 目的体外培养人S C L C 细胞株S B C 3 和H 8 2 并观察其生长特性，以备后续 试验所片j 。 方法体外培养S B C 3 和H 8 2 细胞，采用c e l lc o u n t i n gk i t 一8 试剂盒检测细胞 生长曲线，M y c o A l e r t 支原体检测试剂盒监测所培养细胞有无支原体污染。 结果S B C 3 和H 9 2 细胞传代后经过大概2 4 h 潜伏期，至4 8 h 及7 2 h 进入大 量分裂的对数生长期。大

6、概9 6 h ，细胞达到饱和密度后，生长缓慢井停止进入 平台期，然后退化衰亡( 图2 ) 。S B C 3 和H 8 2 细胞培养不同时间平均吸光度( o p t i c a l d e m i t y , O D ) 值见表1 。试验所用人S C L C 细胞株S B C 3 和H 8 2 没有支原体的污 染。 2 0 1 5 8 1 0 0 5 O 02 44 87 2 9 6 1 2 0 T i m e ( h l 图2 S B C 3 和H 8 2 细胞生长曲线。z 虹n - 5 。 中山大学博士学位论文毒蕈碱胆碱受体3 在小细胞肺癌中的表达及意义 表lS B C 3 和H 8 2 细

7、胞培养不同时间平均O D 值( x 蝇n = 5 ) 结论S B C 3 和H 8 2 体外培养生长良好此研究所培养的肿瘤细胞S B C 3 和 H 8 2 细胞没有被支原体污染，培养至4 8 h 及7 2 h 进入对数生长期，是行M 3 R 受 体检测及功能试验的最佳时间。 第二章毒蕈碱胆碱受体3 在小细胞肺癌中的表达 ； ； “ 7 0 b p 一 6 t 2 1 叩一 3 d 1 b p 一 丌0 b p 一 6 t 2 b p 一 3 4 1 b p S B C 3 H 8 2 图3R T - P C R 检测M 3 R m R N A 在S B C 3 和H 8 2 中的表达 中山大

8、学博士学位论文毒蕈碱胆碱受体3 在小细胞肺癌中的表达及意义 A 硼 S B C 3H 8 2 二：矗 1 3 - a e t i n 一 2 6 5 - 削d + 0 4 0 3 0 2 0 1 0 S B C 3H 8 2 图4 W e s t e r n M o t i n g 检测M 3 R 蛋白在s B c 3 和H 8 2 中的表达( x 虹n = 3 ) 结论人S C L C 细胞株S B C 3 和H 8 2 表达M 3 R ，M 3 R 表达水平在两细胞株问存 在差异。S B C 3 细胞株M 3 R 表达明显强于H 8 2 故选择S B C 3 细胞株进一步研究 M 3 R

9、在S C L C 中的功能。 第三章毒蕈碱胆碱受体3 在小细胞肺癌中的功能研究 第一节毒蕈碱胆碱受体3 在小细胞肺癌增殖中的作用 目的研究M 3 R 在S C L C 细胞增殖中的作用。 方法体外培养人S C L C 细胞株S B C 3 ，采用M T T 比色法研究胆碱受体激动 剂碘化乙酰胆碱( a e e t y e h o l i n ei o d i d e ，A e h ) 及选择性M 3 R 拮抗剂 4 - d i p h e n y l a c e t o x y - N - m e t h y l p i p e r i d i n em e t h i o d i d e (

10、 4 - D A M P ) 对细胞增殖的影响。 试验分组如下：o 正常对照组；不同浓度A e h 组( 1 矿、l0 _ 5 、1 0 4 、1 0 “ 3 M ) ； B o；巴uI芍吐、叱至 中山大学博：l ：学位论文毒蕈碱丑日碱受体3 在小细胞肺癌中的表达及意义 A c h ( 1 0 4 M ) + 不同浓度4 - D A M P 组( 1 0 “ 8 、l o 7 、l 矿、1 0 5 M ) ；不同浓度 4 - D A M P 组( 1 0 。8 、1 0 、1 0 石、1 0 5 M ) 。分别于0 、2 4 、4 8 、7 2 h 通过检测5 5 0n m 6 5 0 n m

11、O D 值判定各组中活细胞数量。 结果胆碱受体激动剂A c h 浓度依赖性地刺激S B C 3 细胞的增殖，1 0 4 和 1 0 0 M 的外源性A c h 在4 8 h 和7 2 h 能够明显地刺激S B C 3 细胞增殖( 尸 O x y l u c i f e r i n + A M P + P P i + C 0 2 + L I G H T M g2 + 1 2 5 2M y c o A l e r t 法检测细胞支原体污染的方法 ( 1 ) 取出4 。C 保存的M y c o A l e r t 支原体检测试剂盒的各试剂，恢复至室温。 ( 2 ) 按说明书所示，用缓冲液配制好反应液

12、和底物液，室温放置1 5 m i n ，使其 充分水化。 ( 3 ) 取2 m l 待测细胞培养液，离心1 5 0 0 r p m ，5 m i n 。 ( 4 ) 取1 0 0 1 x l 离心后的上清液加入发光测量计特用的试管中。 ( 5 ) 加入1 0 0 1 x l 反应液，5 m i n 后测量发光度，得A 值。 ( 6 ) 加入1 0 0 1 x l 底物液，1 0 m i n 后测量发光度，得B 值。 ( 7 ) 计算比值B A 。比值 1 ， 说明培养细胞有支原体的污染，不能继续用于试验，灭活后弃之；比值略高于l ， 属于临界值，隔离细胞培养2 4 h 后复测。 1 2 6 细

13、胞的冻存 ( 1 ) 细胞生长良好，处于对数生长期，约有8 0 - - 9 0 敏密度。 ( 2 ) 按上述方法检测细胞存活率及支原体污染，明确细胞存活率高而且没有支 原体污染后j 能冻存细胞。 ( 3 ) 将细胞冷冻保存液置于室温下待用。 ( 4 ) 按照细胞传代培养操作，收集培养细胞，离心，去除上清液，加入适量冷 冻保存溶液，混合均匀，分装于已标示的冷冻保存管中，1 m l 试管。 ( 5 ) 将冷冻保存管放入己4 。C 过夜预冷的细胞冻存器中，8 0 。C 冰箱过夜后置于 液氮罐中保存。 2 结果 2 1 1 细胞培养S C L C 细胞形态 显微镜下观察S C L C 细胞形似淋巴细胞

14、，核大，胞浆少，形似裸核。S B C 3 为贴壁细胞，接种后2 4 h 基本全部贴壁生长，成多角形或细长型，大概3 “ - - 4 天， 细胞在培养皿中长成敛密单层后，已基本上饱和，需要传代。H 8 2 为悬浮细胞， 1 0 中山大学搏十学位论文 毒簟碱胆碱受体3 在小细胞肺癌中的表达及意义 一般生长3 4 天后细胞聚成团状浮在培养液中，培养液的颜色由红转黄时需要 传代( 见图1 ) 。 2 1 2 细胞生长曲线 S B S 3 和H 8 2 细胞接种后经过大概2 4 h 的潜伏期后，至4 8 h 及7 2 h 进入大量 分裂的对数生长期。在大概9 6 h 的培养后细胞达到饱和密度后，生长缓慢

15、并停 止，进入平台期，然后退化衰亡( 见圈2 ) 。 S B C 3 和H 8 2 细胞培养不同时间所测得的平均O D 值见表l 。 2 1 3 支原件检测 所培养细胞S B C 3 和H 8 2 在试验过程中没有支原体污染。 S B C 3砸 F i g u r e l P h o t o g r a p h so fS B C 3a n d1 t 8 2 T h ep h o t o g r a p h so ft h eS B C 3a n dH 8 2 c e l l sa b o u t2 4 hc u l t u r e ( 2 0 0 ) T h eS B C 3c e l l

16、s8 , i ea d h e r e n tc e l l sa n da p p e a r e d s l e n d e rs h a p eo r p o l y g o nT h e H 8 2c e l l sa r es u s p e m i o nc a l l sa n d g r e w i n c l u m p s 图1 S B C 3 和1 4 8 2 细胞镜下所见。 S B C 3 和H 8 2 细胞培养2 4 h 后镜下所见( 2 0 0 X ) ，S B C 3 细胞贴壁后成细长 形或多角形。H 8 2 细胞悬浮在培养液中聚成团状生长。 中山大学博七学位论文毒覃碱胆碱受体3 在小细胞肺癌中的表达及意义 2 0 vS B C 3 1 S H 8 2 8 1 0 0 5 ，4 O f 02 44 87 29 61 2 0 T i m e ( h ) F i g u r e 2 T h eg r o w