《抗乙型肝炎病毒药物筛选评价体系的建立及肝康栓抗乙型肝炎病毒的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《抗乙型肝炎病毒药物筛选评价体系的建立及肝康栓抗乙型肝炎病毒的实验研究（125页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、华中科技大学 博士学位论文 抗乙型肝炎病毒药物筛选评价体系的建立及肝康栓抗乙型肝炎 病毒的实验研究 姓名：李晖 申请学位级别：博士 专业：内科学（感染病） 指导教师：田徳英 20090506 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 1 抗乙型肝炎病毒药物筛选评价体系的建立及肝康栓 抗乙型肝炎病毒的实验研究 抗乙型肝炎病毒药物筛选评价体系的建立及肝康栓 抗乙型肝炎病毒的实验研究 中文摘要 【目的】 【目的】 建立一套检测乙型肝炎病毒基因的 Taqman 探针实时荧光定量 PCR 系统、分别 利用 HepG2.2.15 细胞模型和鸭乙型肝炎模
2、型于体外、体内研究乙型肝炎病毒，从而 建立并完善抗乙型肝炎病毒药物筛选、评价体系。并利用该体系评价肝康栓体内、外 抗乙型肝炎病毒的作用。 【方法】 【方法】 1.根据病毒基因组和核苷酸序列特点， 分别设计 3 对特异性引物及 Taqman 探针。 利用这 3 对引物分别扩增 HBV DNA、DHBV DNA 及 DHBV cccDNA 目的基因片段。 PCR 产物纯化、回收后，克隆入 pUCm-T 载体，转化 DH5菌株，筛选阳性菌落，提 取重组质粒。重组质粒经 PCR 及测序鉴定后，用于制备实时荧光定量 PCR 的标准品 和绘制标准曲线。通过优化反应体系和循环参数，建立乙型肝炎病毒基因 Ta
3、qman 探 针实时荧光定量 PCR 检测系统。并进一步评价该系统的灵敏度、特异度及可重复性。 2.体外培养 HepG2.2.15 细胞，观察该细胞培养 1、2、4、6、8、10、12、14 天 时的生长情况和 HBsAg、HBeAg 的分泌情况。用 MTT 法检测肝康栓和拉米夫定对 HepG2.2.15 细胞的细胞毒性作用，计算肝康栓和拉米夫定的半数中毒浓度。并分别 用 ELISA 法或 PCR 法检测肝康栓 （12mg/ml、 10mg/ml、 6mg/ml 和 5mg/ml 的终浓度） 与拉米夫定（0.2g/ml、1g/ml、5g/ml 和 25g/ml 的终浓度）作用 4、7、10 天
4、时， HepG2.2.15 细胞培养上清液中 HBsAg、HBeAg、HBV DNA 的抑制作用。计算培养 第 10 天时肝康栓和拉米夫定抑制 HepG2.2.15 细胞上清液中 HBsAg、HBeAg 分泌及 HBV DNA 复制的半数有效浓度。最后评价肝康栓的选择指数。 本课题受国家自然科学基金项目资助（项目编号：本课题受国家自然科学基金项目资助（项目编号：30471533） 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 2 3.分别提取 244 份武汉地区成年樱桃谷鸭血清中的 DHBV DNA，并进行 PCR 扩 增和琼脂糖凝胶电泳。估计
5、武汉地区成年樱桃谷鸭 DHBV 携带率。取 1 日龄樱桃谷 雏鸭 96 只，利用 PCR 法筛选先天 DHBV DNA（）雏鸭用于制备动物模型，并估 计樱桃谷雏鸭 DHBV 自然感染率。通过胫静脉注射 DHBV DNA 强阳性血清（0.2ml/ 只） ，利用先天 DHBV DNA（）雏鸭制备后天感染鸭乙型肝炎病毒动物模型，并计 算 DHBV 造模感染率。 4.采用正常樱桃谷雏鸭研究肝康栓短期毒性反应。将后天感染鸭乙型肝炎病毒动 物模型雏鸭随机分为：模型对照组，ACV 对照组，大、中、小剂量肝康栓治疗组， 每组 12 只； 再取 12 只 2 周龄的正常雏鸭作为正常对照组。 分别于第一次给药前
6、（T0） 、 给药 14d（T14） 、给药 28d（T28）和停药 7d（P7）时，胫静脉取血（0.5ml/只） ，分离 血清，检测肝康栓对雏鸭血清中 DHBV DNA 的抑制情况和血清 ALT、AST 的影响。 并于停药 7d 时将各组鸭处死，统一取肝右叶 2 块组织，分别用于检测肝脏 DHBV DNA、DHBV cccDNA 和组织病理学。 【结果】 【结果】 1. 本实验成功构建了 pUCm-HBV DNA、pUCm-DHBV DNA 和 pUCm-DHBV cccDNA 三种质粒标准品。在（11021109）copies/ml 浓度范围内，三种标准品 的含量与 Ct 值的相关系数 r
7、 分别为1.00、0.999 和0.997。 （51035108） copies/ml 6 个浓度的三种质粒标准品，在同一实时荧光定量 PCR 仪上重复进行 4 次扩增，Ct 值的变异系数均小于 5%。利用本实验所建立的 Taqman 探针实时荧光 定量 PCR 系统检测 HBV DNA、DHBV DNA 和 DHBV cccDNA 的灵敏度分别为：5 10 1copies/ml、5101copies/ml 和 1102copies/ml；并且 HBV DNA 阳性上清液、 DHBV DNA 阳性鸭血清和 DHBV cccDNA 阳性鸭肝组织用本法检测均出现阳性扩 增，而空白的培养基、正常鸭血
8、清及正常鸭肝组织均未出现阳性扩增。 2. HepG2.2.15 细胞按 1106/L 浓度接种、培养后，第 812 天细胞生长状态 最佳； 并且用 ELISA 法检测培养上清发现培养 1 天后， 检测细胞上清液中的 HBsAg 和 HBeAg 均为阳性，其后培养上清液中 HBsAg 及 HBeAg 的分泌量随着培养时间 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 3 的增长而逐渐增加，在培养第 10 天达到高峰。培养第 1-6 天时 HBsAg 分泌增长速 度较 HBeAg 快； 但是整个培养过程中， HBeAg 分泌量均高于同时期 HBsA
9、g 的分泌 量。 肝康栓在（7.560）mg/ml 浓度范围内，对 HepG2.2.15 细胞增殖的抑制作 用随肝康栓的浓度增加而增强，当肝康栓浓度小于 15mg/ml 时，对细胞增殖的抑制 率0.05） 。 肝康栓大剂量组雏鸭血清 DHBV DNA 始终低于同期其他组，且在停药 7 天 时下降至最低（p1.8，如比值偏低 则表明制备物中蛋白质含量偏高。这种情况下，重复实验步骤（7）（10） 。 (11) 将得到的 DNA 溶液移至无菌 Ep 管中，样品于-20保存。 4). 高保真PCR法扩增目的基因片段 (1) 按照以下反应体系分别配制用于扩增不同目的基因片段的PCR扩增液： 灭菌蒸馏水
10、35 l 10PCR Buffer（with Mg2+） 5l dNTP Mixture（各10mmol/L） 1l Primer 1（各10mol/L） 2l Primer 2（各10mol/L） 2l Taq DNA聚合酶（5U/l） 1l 模板DNA 4l Total 50l (2) 混合均匀后，稍离心。并设立阴性对照组（即：不加入模板） (3) 循环参数设定： 94 2min (预变性) 加加 样样 顺顺 序序 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 20 94 30sec(变性) (59、56、55) 30sec(退火) 72
11、1min(延伸) 72 7min (末轮延伸) （由于扩增不同目的基因片段的引物不同，故扩增 HBV DNA、DHBV DNA 及 DHBV cccDNA 基因片段的退火温度分别设定为 59、56、55） 5). PCR产物的电泳鉴定和回收 (1) PCR产物的电泳鉴定：2.5%琼脂糖凝胶，DNA Marker I，3V/cm电压降，电泳 60min； (2) PCR产物的纯化回收（按说明书进行，具体如下） ： 、 首次使用前，在Rinse B中添加56 ml的100%乙醇； 、 在紫外灯下切出含目的DNA的琼脂糖胶块 （尽量切除不含目的DNA部分的 凝 胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率
12、） ，放入1.5ml无菌离心管中。此 步骤在紫外灯下操作的时间尽可能短，以防止DNA损伤； 、 切碎胶块以提高目的DNA的回收率； 、 胶块称重， 计算胶块体积。 计算胶块体积时， 以1mg=1l进行计算。 每100mg 回收的琼脂糖凝胶中加入500l DR-I Buffer， 均匀混合后65水浴加热融化 胶块10min（每隔2min 混合均匀一次） ，使胶完全溶化； 、 向胶块融化液中加入1/2DR-I Buffer体积量的DR-II Buffer，均匀混合。再加 入 终浓度为20%的异丙醇。 、 将上述混合液移至吸附柱内，并套入收集管中，12000 rpm低温离心1min； 、 将收集管中
13、的滤液再此加入吸附柱中，12000 rpm低温离心1min，以提高 DNA 的回收率； 30cycles 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 21 、 弃去收集管中的废液，12000 rpm低温离心2min； 、 在吸附柱内加入500 l的Rinse A，12000 rpm低温离心30s，弃滤液； 、 在吸附柱内加入700 l的Rinse B，12000 rpm低温离心30s，弃滤液； 、 重复操作步骤； 、 将吸附柱置于一支1.5 ml的无菌离心管中，在吸附柱膜的中央处加入25 l 60 的Elution Buffer，室温静置1m
14、in。 、 12000 rpm低温离心1min洗脱吸附柱上的DNA，收集滤液，即获得目的DNA 液。 6). PCR产物的T-A克隆 (1) DNA连接反应：4l PCR回收产物、2l pUCm-T载体、50%的PEG 2l、10连接 缓冲液2l、T4 DNA连接酶（5U/l）2l，加入dd H2O至20l（T4DNA连接酶最 后加入） 。将反应液混合均匀后，20孵育1小时； (2) 质粒转化 增菌与制备感受态细胞增菌与制备感受态细胞 、 灭菌的培养瓶中加入50ml LB培养基，瓶口用火焰消毒； 、 用火焰消毒接种针，带其冷却后，挑取一个克隆的DH5菌落； 、 将挑取的菌落转移至培养基后，置培
15、养瓶于37下摇动过夜（250r/min）至 细 菌OD600为0.375； 、 将菌液移至一个无菌的冷离心管中，冰浴 510min。于4下，1600g离 心 7min，弃上清； 、 细菌沉淀用10ml 0.1mol/L的冰CaCl2溶液重悬，于4下，1000g离心5min， 弃 上清； 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 22 、 细菌沉淀用10ml 0.1mol/L的冰CaCl2溶液重悬，冰浴30min，于4下，1100 g 离心5min，弃上清； 、 2ml 0.1mol/L的冰CaCl2溶液重悬后，分装（每管250 l） ，立即冻存于-70待 用； 质粒质粒DNA的转化的转化 、 在1.5ml无菌圆底试管内，分别加入50ng各目的DNA，置于冰上。 、 将装有感受态细菌的管子握于手中使其迅速融化，立即将200l感受态菌液 加入到圆底试管中，轻轻旋转，混合均匀；冰浴10min； 、 将管子置于42水浴中进行热激2min，使之热休克，然后加入1ml LB培养 液于试管中，37摇动培养1h； 平板培养细胞平板培养细胞 、 在90mm LB/琼脂平板表面（含Amp终浓度为60g/ml）加40l X-gal液和16l IPTG液，并用玻璃无菌涂布器将其均匀铺开，置于37至液体消失；
