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1、博 士 学 位 论 文 博士研究生: 导师: 罗小玲 徐锦堂 教授 论 文 题目 : 异种角膜基质为载体构建 ( 中 英 文 )人工生物角膜的研究 S t u d y o n c o n s t r u c t i n g o f a r t i f i c i a l b i o l o g i c c o r n e a u s i n g b e t e r o g e n i c c o r n e a l s t r o ma a s c a r r i e r 本课题受下列基金资助 国家自然科学基金( 3 0 3 7 1 5 1 9 ) 广东省重大科学技术项目 ( 2 0 0 1
2、A 3 0 2 0 2 0 1 0 2 ) 深圳市科技计划重点项目 ( 2 0 0 2 0 4 0 3 0 ) 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。 据我所知， 除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名 签 字 日 期 : 夕 叭 心 年 i t - 月 。 9 F 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解T r P A -4 关保留、
3、使用学位论文的规定，有 权保留并向国关部门或机构送交论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和借 阅。 本人授权以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学 位 论 文 储 签 名 :汤犷 签 字 日 期z it ， 年牛 月 2 乡 日 导师签名 签字日期: 4x 壹 : 。 十 年 f 月 茗日 学位论文作者毕业后去向: 工作单位: 通 讯地址: 电话: 邮编: 暨南大学博士学位论文( 2 0 0 4 ) 异种角膜基质为载体构建人 1 . 生物角膜的研究( 中文摘要) 异种角膜基质为载
4、体构建 人工生物角膜的研究 博士研究生: 导师: 罗 小 玲 徐 锦 堂教授 摘 要 角膜病是主要的致盲性眼病之一， 据 1 9 9 1 年 WH O统计， 全世界约有角膜 盲患者 1 0 0 0万，我国约3 5 0 万， 居世界第一位。到目前为止，同种异体角膜移 植是角膜盲复明的主要手段，但由于供体材料来源匿乏，严重制约了该手术的 开展和普及。随着人口平均寿命的延长，老龄供体角膜由于内皮细胞稀疏，不 适用于角膜移植，在可获得的年轻供体中，除去 H I V、肝炎、癌症、己做屈光 手术等供体角膜:能用的材料又不到一半。因此，寻找新的角膜供体材料和降 低移植后免疫排斥反应是眼科界亚待解决的问题。
5、人T - 生物角膜 ( a r t i f i c i a l b i o l o g i c c o rn e a ) ，又称组织Z程角膜 ( t i s s u e e n g i n e e r i n g o f c o rn e a )是近年随着生物材料、细胞生物学以 及人工器官 研制的 迅速进展而出现的高科技项目，是利用组织工程、细胞工程技术，以人工合成 材料或生物材料为载体 ( 支架) ， 体外重建角膜组织， 构建与正常角膜功能等效 的活性人工角膜。随着生命科学的发展和研究的不断深入，用人工生物角膜取 代人供体角膜有望成为现实，这将非常有利于角膜病的治疗，具有重要的临床 意义和使
6、用价值，是眼科界目前研究的热点。特别是构建具有我国自主知识产 权和技术特点的人工生物角膜，是我国防盲治盲研究的重要课题之一。 体外构建人工生物角膜的研究国内外刚刚起步，有许多问题尚待解决，例 如:目前采用的人工合成胶原材料做载体， 存在着透明性差、弹性差、 降解快、 暨南大学博士学位论文( 2 0 0 4 ) 异种角膜基质为载体构建人 _ 生物角膜的研究( 中文摘要) 角膜细胞排列紊乱、胶原易被胶原酶消化、构建组织在活体不够稳定等许多缺 点。因此，体外重建角膜组织尚 需解决的问题有:寻找理想的载体材料; 如何使角膜细胞在载体上达到功能性层次结构的构建;体外构建的角膜组织 在活体的生物学功能鉴定
7、:体外培养细胞的 “ 永生化”问题:载体材料与 眼组织的长期生物相容性; 角膜的外观设计和曲率的构建。 本课题从四个方面对构建人工生物角膜进行深入地研究。第一部分:对构 建人工生物角膜载体材料进行研究从细胞免疫和体液免疫二方面，比较猪、 兔、鸡三种角膜基质的抗原性，筛选一种来源广泛，抗原性很低，具有角膜细 胞自 然生长环境的天然生物胶原，做为构建角膜组织的载体材料。第二部分: 探讨体外构建角膜组织的方法和技术，应用二维立体气一液交界面培养技术， 以冷冻脱水保存的猪角膜基质/ 后弹力膜为载体构建人工生物角膜。第三部分: 将体外构建的角膜内皮细胞行同种异体移植，观察体外培养细胞在活体的生存 情况，
8、探讨角膜内皮细胞移植的手术方式:第四部分:应用绿色荧光蛋白基因 转染技术，标记体外构建的角膜内皮细胞，活体示踪内皮细胞的生长情况，鉴 定移植后活体细胞的种子来源。 本课题旨在为体外构建人工生物角膜奠定实验基础。 第一部分构建人工生物角膜载体材料 的生物相容性研究 目前体外重建角膜组织最大的难题是载体材料。本研究选用异种角膜基质 作为载体材料，其研究背景如下:许多实验已证明，角膜基质的免疫原性很 低，异种板层植入后，未诱导出受体的角膜排斥反应;临床上有异种表面镜 片术， 异种板层移植术成功病例的报告; 角膜基质具有整齐排列、 相互平行、 生理间隙、同等屈光指数的胶原纤维，是角膜细胞的自 然生长环
9、境，这种天然 的胶原结构和屈光指数是目 前人工合成材料无法达到的;来源广泛，易于获 取、加工和保存;随着生物技术的发展，敲除致敏、致病基因的转基因动物 问世， 可以得到大量无抗原性、 天然的角膜胶原， 加工成各种不同规格的载体。 暨南大学博十学位论文( 2 0 0 4 ) 异种角膜基质为载体构建人_ 生物角膜的研究( 中文摘要) 但是在众多的动物种系中，究竟选用哪 一 种动物的角膜基质更适合做载体 呢?本部分的研究就是为解决这一问题而设计的。 一、异种角膜基质异位移植对大鼠 外周血T细胞亚群的影响 目的 应用免疫荧光标记及流式细胞仪检测异种角膜基质异位移植对 S D大鼠外 周血C D 4 ,
10、C D 8 , C D 2 5 十 、C D 7 1 + 表型的动态影响，从细胞免疫方面比较猪、 兔、鸡角膜基质的抗原性大小，为载体材料的筛选提供实验依据。 方法 1 .动物与分组: 受体:S D大鼠4 5 只。 供体:新鲜猪、公鸡、新西兰大白 兔角膜基质。分组:大鼠随机分为5 组，每组9只，第一组为阴性对照组，第 二 组为阳性对照组 ( 诱导排斥反应组) ，第三、四、五组为猪、兔、鸡实验组。 2 . 手术方法 2 . 1实验组:在大鼠近颈背部皮肤剃毛 1 c mx l c m，做0 . 5 c m横切口，分离 皮下形成囊袋， 分组植入湿重2 5 m g 的角膜基质， 3 - 0 丝线间断缝合
11、皮肤切口。 2 .2阴性对照组:与实验组同样做皮肤切口、分离成囊袋，但不植入角膜 基质。 2 .3阳性对照组:在大鼠近颈背部皮肤剃毛2 c m X 2 c m，分离并剪除 1 .2 c m X 1 .6 c m全厚皮肤，形成植床创面，取 1 .4 c m X 1 . 8 c m兔背部全厚皮肤作供片， 覆盖于大鼠背部创面，3 . 0 丝线间断缝合8 针。 3 . 血样的采集及制备:术后7 d . 1 4 d , 2 8 d ，取尾部抗凝血，按免疫荧光抗 体标记分组制备血样。 4 . 应用流式细胞仪检测大鼠外周血C D 4 , C D 8 , C D 2 5, C D 7 1 的动态表达 5 .
12、术后观察:观察皮肤及伤口愈合情况。 6 . 统计学处理:实验数据以均数士 标准差 ( 又土 S ) 表示， 应用S P S S 1 0 .0 暨南人学博士学位论文( 2 0 0 4 ) 异种角膜基质为载体构建人 上 生物角膜的研究( 中文摘要) 统计软件进行单因素方差分析及两两比较 结果 1 . 皮肤伤口愈合情况:实验组和阴性对照组植入处皮肤无红肿，无渗出及 其它改变，伤口整齐，愈合良好。阳性对照组由于排斥反应出现，移植皮瓣从 1 0 d开始周边变干、 发黑. 逐渐向中央移行， 1 5 - 2 0 d 完全变黑、 变硬， 约2 8 d - 3 5 d , 皮瓣结痴，开始脱落。 2 . T 细胞
13、表达结果 2 . 1猪角膜基质组各时相表达的T细胞亚群活化率，与阴性对照组比 较差 异无显著性意义 ( P 0 . 0 5 ) . 2 . 2兔角膜基质组术后7 d C D 4 升高， 与阴性对照组比较差异具有显著性意 义 ( P 猪，猪角膜基质的抗原性最低。 3 ， 异种角膜基质植入后诱导大鼠 机体的免疫系统启动，在术后 7 d出 现， 由于低的抗原性，机体通过自身的免疫调节网络，抑制了排斥反应的发生，因 而术后1 4 d , 2 8 d 未检测出有统计意义的T细胞表达。 4 . 再次证明:角膜基质的抗原性很低，异种植入后未诱导出机体排斥反应 暨南大学博士学位论文( 2 0 0 4 ) 异种
14、角膜基质为载体构建人_ L 生物角膜的研究( 中文摘要) 发生。 二、异种角膜基质异位移植对大鼠 血清细胞因子水平的影响 目的 应用双抗体夹心E L I S A法测定异种角膜基质移植后大鼠血清 I L - 2和 I L - 4 水平的变化，分析 T h l , T h 2相关细胞因子与 异种基质植入后机体免疫反应与 免疫耐受的关系，进一步比较三种基质抗原性大小。 方法 1 2 3 4 勺 6 动物与分组;方法同本部分的 “ 一”所述。 手术方法:方法同本部分的 “ 一”所述。 血样的采集与制备:手术后7 d , 1 4 d , 2 8 d 尾部取血，分组制备血清。 按免疫学双抗体夹心E L I
15、 S A法操作各步骤。 绘制标准曲线，在4 5 0 n m处测O D值。 统计学处理:实验数据以均数士标准差 ( x 士 S )表示，应用S P S S 1 0 .0 统计软件进行单因素方差分析及两两比较。 性意义 猪基质组术后各时相I L - 2 , I L - 4 血清水平与阴性对照组比较差异无显著 ( P 0 . 0 5 ) . 果1 结 2 免基质组术后7 d I L - 2 升高，1 4 d I L - 4 升高，与阴性对照组比 较差异均 具有显著性意义( P 0 . 0 5 ) a t e a c h t i m e a ft e r s u r g e ry . 2 . C o
16、m p a r e d w i t h n e g a t i v e c o n t r o l g r o u p , t h e e x p r e s s i o n o f C D 4 + w a s i n c r e a s e d i n r a b b i t c o rn e a l s t r o m a ( R C S ) g r o u p ( p p i g . T h e i m m u n o g e n i c i t y o f p o r c i n e c o rne a l s t r o m a i s t h e l o w e s t t h a n r a b b i t a n d c h i c k e n . 3 . C o rn e a l s t r o m a i s l o w i m m u n o g e n i c i ty t i s s u e s , a n d c a n t i n d u c e r e c i p i e n t o c
