《度他雄胺对大鼠附睾精子成熟和生育影响的实验研究和机制探讨》由会员分享，可在线阅读，更多相关《度他雄胺对大鼠附睾精子成熟和生育影响的实验研究和机制探讨（121页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、复旦大学 博士学位论文 度他雄胺对大鼠附睾精子成熟和生育影响的实验研究和机制探 讨 姓名：谢淑武 申请学位级别：博士 专业：生殖药理学 指导教师：曹霖 20070410 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明 并表示了谢意。 作者签名：日期 论文使用授权声明 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用
2、影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名： 一一 导师签名日期 复旦大学博上学位论文度他雄胺对大鼠附阜精子成熟和生育影响的实验研究和机制探讨 度他雄胺对大鼠附睾精子成熟和生育影响的实验研究和机制探讨 摘要 目的： 研究度他雄胺对大鼠附睾精子成熟和生育的影响，探讨度他雄胺抗雄性生育 可能的作用机制，探索调节雄性生育的睾丸后作用靶点，初步建立附睾相关调节 生育基因表达谱数据库。 方法： 1 使用度他雄胺2 0 和4 0 m g k g d 大鼠灌胃给药，同时以氯丙二醇lo I l l g ，k g ，d 作 为参照组，连续2 周。给药结束后雄鼠与处于动情前期的雌
3、鼠按2 ：1 合笼，计算 雌鼠的交配指数、受孕指数和生育指数，直接评价雄鼠生育力；采用计算机辅助 精子分析系统分析大鼠附睾精子活力和形态，在此基础上合并使用透射电镜技术 对各组附睾尾部精子进行透射电镜分析，评价度他雄胺对大鼠精子成熟的影响； 采用S Y B R - 1 4 和p r o p i d i u mi o d i d e ( P I ) 双重荧光染色计算精子存活率；采用E l i s a 法测定大鼠睾酮( t e s t o s t e r o n e ，T ) 和双氢睾酮( d i h y d r o t e s t o s t e r o n e ，D H T ) 血清浓 度，评
4、价度他雄胺对雄鼠雄激素水平的影响：采用精密电子天平对各组睾丸、附 睾、前列腺和精囊进行称重，评价度他雄胺对大鼠生殖器官重量的影响；采用 H E 染色法对各组睾丸和附睾进行组织学分析，同时采用透射电镜技术对附睾上 皮细胞超微结构进行分析，评价度他雄胺对大鼠主要生殖器官组织学的影响。 2 采用差异贴壁分离、不锈钢过滤网过滤和添加D H T 相结合的方法，进行大鼠 附睾上皮细胞的原代分离培养；使用C C K 8 试剂盒测定附睾上皮细胞的增殖活 性，绘制细胞的生长曲线；使用角蛋白和波形蛋白抗体对附睾上皮细胞进行免疫 细胞染色，以鉴定附睾上皮培养细胞的纯度。 3 通过度他雄胺体外作用于附睾上皮细胞，采用
5、不同给药浓度和作用时间，评 价了度他雄胺对离体大鼠附睾上皮细胞活性的作用。具体使用C e l lC o u n t i n g K i t 8 ( C C K 8 ) 检测了不同药物浓度和作用时间下，附睾上皮细胞增殖活性的改 变，通过测定光密度和抑制率，计算度他雄胺对附睾上皮细胞体外作用的I C 5 0 ； 在此基础上使用硫代巴比妥酸和4 硝基酚a D 吡哺葡萄糖苷法测定了度他雄 胺对附睾上皮细胞分泌蛋白唾液酸和泓l ，4 糖苷酶活性的影响；使用透射电镜 对药物作用后附睾上皮细胞的超微结构进行分析，评价度他雄胺对体外附睾上皮 细胞形态功能的影响。 4 使用A f f y I I l e t i
6、 xG e n o m eR a t2 3 02 0O l i g o m i c r o a r r a y 对度他雄胺组、氯丙二醇 复旦大学博士学位论文度他雄胺对大鼠附睾精予成熟和生育影响的实验研究和机制探讨 组与正常大鼠附睾基因表达差异进行研究。具体采用T r i z o l 对每组3 个附睾( 共 9 个) R N A 分别进行抽提，并使用紫外定量与变性凝胶电泳质检，然后将各组 R N A 样本充分混合并纯化；使用A f f y m e t r i xo n e - c y c l ec D N AS y n t h e s i sK i t 和 A f f y m e t r i x
7、G e n e C h i pS a m p l eC l e a n u pM o d u l e 进行c D N A 合成与纯化；使用 G e n e C h i pI V TL a b e l i n gK i t 和G e n e c h i pS a m p l eC l e a n u pM o d u l e 进行c R N A 的合 成、生物素标记和纯化；c R N A 定量检测后，对其进行片段化处理( 大小 3 5 - 2 0 0 b p ) ；接着在G e n e c h i ph y b r i d i z a t i o nO V f M I6 4 0 进行芯片杂交，1
8、 6 小时；洗 脱、染色后，将芯片放入G e n e C h i pS c a n n e r3 0 0 0 进行扫描，使用G e n e C h i p o p e r a t i n gs o i t w a r e ( G C O S ) 对扫描图像进行处理分析。各芯片探针信号经整体归一 化( G l o b a lN o r m a l i z a t i o n ) 后进行比较，根据信号表达强弱筛选出差异基因。使 用G e n e s p r i n gG X7 3 1 和F a t i g o + 对差异基因进行进一步的功能分类。使用实时 定量R T - P C R 对部分差异基因
9、进行验证，综合评价度他雄胺和氯丙二醇对大鼠附 睾基因表达的影响。 结果： 1 度他雄胺低高剂量组血清D H T 水平较阴性对照组( 3 2 8 n m o l L ) 均明显降低 ( P O 0 5 ) ，而 度他雄胺高低剂量组血清D H T 水平较对照组则均明显降低( P o 0 5 ) ，前列腺和精囊重量则较正常组有显著差异( P 5 0 ；2 相对于对照组，度他雄胺组基因表达 水平改变应大于2 倍。据此相对于正常组，度他雄胺组附睾转录子表达显著变化 的有1 9 9 6 个，占附睾转录子表达总数的1 0 9 n o ，其中下调9 5 0 个( C h a n g e p - v a l u
10、 e O 9 9 7 ) ，上调1 0 4 6 个( C h a n g ep - v a l u e 5 0 ；2 相对于 对照组，氯丙二醇组基因表达水平改变应大于2 倍。相对于正常组，氯丙二醇组 附睾基因表达显著变化的有1 6 9 个，其中下调基因7 9 个( C h a n g ep - v a l u e 0 9 9 7 ) ， 上调基因9 0 个( C h a n g ep - v a l u e 0 0 0 2 5 ) 。使用F a t i g o + 对上述差异基因进行功能 分类( G e n ec l a s s i f i c a t i o n s ) ，其中在下调基因中，
11、未知基因2 5 0 个，分析基因为 5 9 2 个；在上调基因中，未知基因3 3 6 个，分析基因为6 0 1 个( 具体分析基因比 例见图4 1 8 ) 复旦大学博士学位论文度他雄胺对大鼠附睾精子成熟和生育影响的实验研究和机制探讨 1 0 0 9 0 8 0 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 Ohi 丑| f l l z f l l一三口二 哮嚣多彩渺 图4 1 8 氯丙二醇组附睾差异基因和功能分析基因汇总表 F i g 4 1 8S u m m a r y f o r d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e de p i
12、d i d y m a lg e n e s i n c h l o r h y d r i ng r o u p ( c o n t r a s t e dt oc o n t r o lg r o u p ) 接着根据分子功能( M o l e c u l a rf u n c t i o n ) 、生物学途径( B i o l o g i c a lp r o c e s s ) 和细胞组件( C e l l u l a rc o m p o n e n t ) 分别对差异基因进行了进一步的功能分类 ( F u n c t i o n a lc l a s s i f i c a t i
13、 o n ) ，具体见图4 1 9 ，4 2 0 和4 2 l 。 拍 ：1 5 五 詈 。l O o 是 uS 0j | | d 。一t 一一* 。墨删c 。髂鲈一” 一一。 一州二一州栅P D i f f e r e n tg e n e sf o ri o l e c u l a rf u n c t i o n sb e t w e e nt w og r o u p s 图4 1 9 氯丙二醇组与阴性对照组附睾主要差异基因分子功能分类 F i g 4 1 9M o l e c u l a rf u n c t i o nc l a s s i f i c a t i o nf o r
14、m a j o rd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e d e p i d i d y m a lg e n e sb e w e e nc h l o r h y d r i na n dc o n t r o lg r o u p 崩Ia_l眦虫粤 复旦大学博士学位论文度他雄胺对大鼠附睾精子成熟和生育影响的实验研究和机制探讨 攀一 万 玉 一二 i ； 酉f _ E百 l l 魏 纛 D i f f e r e n tg e n e sf o rb i o l o g i c a lp r o c e s sb e t w e e nt w
15、og r o u p s 图4 2 0 氯丙二醇组与阴性对照组附睾主要差异基因生物途径功能分类 F i g 4 2 0B i o l o g i c a lp r o c e s sc l a s s i f i c a t i o nf o rm a j o rd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e d e p i d i d y m a lg e n e sb e w e e nc h i o r h y d r i na n dc o n t r o lg r o u p l 艮 醪一 抟 ； 五丑 l 溉。 i 一一一：，一” p ”：一一
16、” 图4 2 1 氯丙二醇组与阴性对照组附睾主要差异基因细胞组件功能分类 F i g 4 2 1 C e l l u l a r c o m p o n e n t s c l a s s i f i c a t i o nf o rm a j o rd i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e de p i d i d y m a lg e n e sb e w e e nc h l o r h y d r i na n dc o n t r o lg r o u p 8 0 oo|ooooo o 踞 曲 埔 m o o p口目tg 差异基因主要涉及大分子的代谢和转运、初级代谢过程、细胞代谢、生物学 过程调控、免疫学调控、离子结合，水解酶和氧化还原酶活性等基因。而涉及到 生殖功能和甾体激素代谢的基因则极少，说明氯丙二醇在抗生育的同时几乎不影 响其他的生殖功能。 2
