年轻骨髓间充质干细胞可通过细胞融合改善年老骨髓间充质干细胞功能

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1、广州医学院 硕士学位论文 年轻骨髓间充质干细胞可通过细胞融合改善年老骨髓间充质干 细胞功能 姓名：黎佼 申请学位级别：硕士 专业：心血管内科学 指导教师：刘世明 20100501 广州医学院硕士研究生 年轻骨髓间充质干细胞可通过细胞融合改善年老骨髓间充质干细胞功能 2 年轻骨髓间充质干细胞可通过细胞融合改善年老骨 髓间充质干细胞功能 年轻骨髓间充质干细胞可通过细胞融合改善年老骨 髓间充质干细胞功能 硕士研究生： 黎 佼 导 师： 刘世明 教授 中文摘要 中文摘要 研究背景及目的 研究背景及目的 骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC）对

2、间充质 组织功能的维持和修复起重要作用。干细胞的减少可能导致脑、肝脏、皮肤、骨 骼等相关退行性疾病的发生。小鼠BMSC随年龄增加，多种细胞功能发生改变， 包括细胞集落形成单位功能下降，成骨细胞、脂肪细胞以及成软骨细胞分化能力 下降，细胞增殖能力下降，细胞端粒酶活性下降，端粒长度缩短。最近的研究表 明细胞融合作为一种有效的再调控细胞功能的方法，得到广泛关注。有研究表明 骨髓间充质干细胞可与小肠干细胞、肝脏细胞、心肌细胞等细胞融合并改变其功 能。本文的研究目的是诱导年轻与年老小鼠BMSC融合，探讨融合后年轻BMSC 对年老BMSC功能的影响。 研究方法 研究方法 年轻 (2-3月龄) 及年老 (1

3、8-24月龄) C57BL/6 小鼠BMSC在红色荧光染料 PKH26标记后分别与年轻及年老绿色荧光蛋白转基因C57BL/6小鼠BMSC通过聚 乙烯二醇 (PEG 1500) 诱导，建立细胞融合模型。通过流式细胞仪鉴定细胞融合 率和细胞表面特异性抗原的表达。 免疫荧光显微镜观察融合细胞形态及细胞核特 性。通过细胞计数比较5组细胞(年轻组Y，年老组O, 年轻融合组Y-Y, 年轻年老 融合组Y-O,年老融合组O-O) 在2d、4d、6d、8d的细胞增殖能力。诱导细胞向成 骨细胞及脂肪细胞分化，比较5组细胞的分化能力。 广州医学院硕士研究生 年轻骨髓间充质干细胞可通过细胞融合改善年老骨髓间充质干细胞

4、功能 3 结果结果 通过 PEG 诱导，可获得 30.45%4.13%的融合细胞，3 组不同年龄融合组的 细胞融合率无统计学差异，具体数值为 (29.41%3.00% vs. 30.54%1.20% vs. 31.41%6.63%) ，P0.05。融合细胞表达间充质干细胞表面特异性抗原 CD44、 Sca-1，而不表达造血干细胞表面特异性抗原 CD34、CD117、CD31、CD45。在 2d、4d、6d、8d，Y-O 组细胞数量增加百分率比 O-O 组均显著增高，具体数值 为 (122.2%4.6%) vs. (104.64%1.25%)； (213.25%15.29%) vs.(130.0

5、2%6.82%)； (318.46%19.86%) vs. (179.4%9.54%)；(439.98%24.09%) vs. (240.03%28.07%)；P 0.05。代表成骨细胞分化能力强弱的茜素红染色阳性率 和代表脂肪细胞分化能力强弱的油红 O 染色阳性率，Y-O 组比 O-O 组均显著增 高，具体数值分别为(25.46%1.52%)vs.(13.85%1.69%)，P 0.01；(12.99% 2.61%)vs.(6.03%1.71%)，P 0.05. Fused BMSC coincided with the common BMSC were reactive to the BM

6、SC lineage-specific CD44, Sca-1 surface markers and negative for the hematopoietic stem cells (HSCs) lineage-specific surface markers such as CD34,CD117,CD31,CD45. Y-O group percentage of increase cell number compared to O-O group were significantly greater at days 2, 4, 6, and 8, the detail numbers

7、 were (122.2%4.6%) vs. (104.64%1.25%)； (213.25%15.29%) vs.(130.02%6.82%)；(318.46%19.86%) vs. (179.4%9.54%)； (439.98%24.09%) vs. (240.03%28.07%)；P 0.05. Quantifying the positive area stained with Alizarin Red which represented osteogenic differentiation potential of BMSC showing significantly higher

8、percentage in Y-O group compared to O-O group (25.46%1.52%) vs. (13.85%1.69 %), P 0.01. Y-O group also have more higher percentage of the positive area stained with Oil Red O which represented adipogenic differentiation potential of BMSC than O-O group (12.99% 2.61%) vs. (6.03%1.71%), P 0.05 ) (图1)。

9、 图图 1 流式细胞仪检测细胞融合率。年轻（Y, 2-3 月龄）和年老细胞（O, 18-24 月 龄）C57BL/6 小鼠 BMSC 在 PKH26 标记后分别与年轻及年老 C57BL/6 绿 色荧光蛋白转基因小鼠 BMSC 通过 PEG 1500 诱导细胞融合。可获得 30.45%4.13%细胞融合率。 三组之间无统计学差异 （Y-Y 组, Y-O 组, O-O 组）. x s. n=7. 广州医学院硕士研究生 年轻骨髓间充质干细胞可通过细胞融合改善年老骨髓间充质干细胞功能 13 2融合细胞形态特征及表面抗原表达融合细胞形态特征及表面抗原表达 免疫荧光显微镜下红色荧光及绿色荧光均表达的为融合

10、细胞（黄色）。诱导 融合培养7d时，可见正在融合的双核或已完全融合的单核融合细胞；培养14d及 21d时只见已完全融合的单核融合细胞。 (图2) 通过流式细胞仪检测普通BMSC及 融合BMSC表面特异性抗原表达， 表达BMSC特异性抗原CD44 （94.48%2.20%） , Sca-1 （79.7%1.10%） ， 而不表达造血干细胞表面特异性抗原CD34 （1.22%0.28%） , CD117(0.23%0.10%), CD31(1.43%0.22%),CD45 (0.41%0.10%)。(图3) 3细胞增殖能力检测细胞增殖能力检测 在2d、4d、6d、8d，Y组细胞增殖能力均比O组强，

11、细胞增加百分率详细 数 值 为 ： (145.15%8.25%)vs.(105.09%5.58%) 、 (251.83%10.62%) vs. (154.05%11.18%)、(397.27%32.44%) vs.(256.52%20.52%)、 (555.68%31.09%)vs.(367.71%18.71%)，P 0.05。Y-O组细胞数量增加百分率比 O-O 组 均 显 著 增 高 ， 分 别 为 ： (122.20%4.60%) vs.(104.64%1.25%) 、 (213.25%15.29%) vs.(130.02%6.82%)、 (318.46%19.86%) vs. (179

12、.40%9.54%)、 (439.98%24.09%) vs.(240.03%28.07%)，P 0.05。Y-Y组与Y组，O-O 组与O组 细胞增殖能力无统计学差异。（图4） 4成骨细胞分化能力检测成骨细胞分化能力检测 Y 组成骨细胞分化能力比 O 组强，茜素红染色阳性百分率为： （30.55%3.18%）vs.（16.25%2.70%），P 0.01。Y-O 组茜素红染色阳性百分 率比 O-O 组显著增高：(25.46%1.52%)vs.(13.85%1.69%)，P 0.01。Y-Y 组与 Y 组，O-O 组与 O 组成骨细胞分化能力无统计学差异（图 5）。 5脂肪细胞分化能力检测脂肪细

13、胞分化能力检测 Y 组脂肪细胞分化能力比 O 组强，油红 O 染色阳性百分率为： （14.46%2.63%）vs.（6.52%2.35%），P 0.02。Y-O 组油红 O 染色阳性百分 率比 O-O 组显著增高：(12.99%2.61%) vs.(6.03%1.71%)，P 0.05。Y-Y 组与 Y 组，O-O 组与 O 组脂肪细胞分化能力无统计学差异（图 6）。 广州医学院硕士研究生 年轻骨髓间充质干细胞可通过细胞融合改善年老骨髓间充质干细胞功能 14 图图 2 荧光显微镜观察融合细胞形态学特征(400)。细胞融合后可7天可观察到正 在融合的细胞（双核）和完全融合的细胞（单核）。细胞融合

14、后可14天及 21天只能观察到完全融合的细胞。蓝色（(DAPI），绿色（GFP细胞），红 色（RFP细胞），黄色（融合细胞）。 广州医学院硕士研究生 年轻骨髓间充质干细胞可通过细胞融合改善年老骨髓间充质干细胞功能 15 图图 3 流式细胞仪检细胞表面特异性抗原表达。融合后细胞与正常 BMSC 细胞一 样表达 BMSC 特异性细胞表面抗原 CD44, Sca-1( 图 A )，而不表达造血干 细胞特异性细胞表面抗原 CD34, CD117,CD31,CD45 ( 图 B ).x s. n=4. 图图 4 细胞增殖能力检测。在第 2，4，6，8 天，Y 组 与 O 组相比， Y-O 组与 O-O

15、组相比细胞增殖能力增强。x s. n=3. * p0.05 Y vs. O, Y-O vs. O-O. 广州医学院硕士研究生 年轻骨髓间充质干细胞可通过细胞融合改善年老骨髓间充质干细胞功能 16 图图 5 成骨细胞分化能力检测(40)。茜素红染色阳性率百分比比较，Y 组比 O 组明显升高，具体数值为 (30.55%3.18%)vs.(16.25%2.70%), Y-O 组比 O-O 组明显升高，具体数值为(25.46%1.52%) vs.(13.85%1.69%). x s. n=3. * P 0.01. 广州医学院硕士研究生 年轻骨髓间充质干细胞可通过细胞融合改善年老骨髓间充质干细胞功能 1

16、7 图图 6 脂肪细胞分化能力检测(200)。油红 O 染色阳性率百分比比较，Y 组比 O 组明显升高， 具体数值为(14.46%2.63%) vs. (6.52%2.35%), Y-O 组比O-O 组明显升高， 具体数值为(12.99%2.61%) vs. (6.03%1.71%) .x s. n=3. * P 0.05. 广州医学院硕士研究生 年轻骨髓间充质干细胞可通过细胞融合改善年老骨髓间充质干细胞功能 18 讨讨 论论 骨髓间充质干细胞（BMSC）对间充质组织功能的维持和修复起重要作用。 大脑、肝脏、皮肤和骨骼等器官和组织的退行性疾病，以及与年龄相关的退行性 疾病的发生可能与干细胞数量减少和功能下降有关5。近几年研究发现年老供体 来源与年轻供体来源细胞相比，多种细胞功能下降6, 7。最近细胞融合机制成功 解释