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1、抗菌肽的作用机制及其抗病毒活性,刘建根,1、什么是抗菌肽,抗菌肽（AMPs）是一类广泛存在于自然界生物体中的小肽类物质，它是机体先天性免疫系统的重要组成部分。由于抗菌肽对细菌、真菌、寄生虫、病毒、肿瘤细胞等有着广泛的抑制作用，并且随着越来越多的抗生素耐药微生物的出现，使得抗菌肽在医药行业和食品添加剂等领域有良好的应用前景。本文综合近年来抗菌肽的研究，概述了抗菌肽的来源、功能、作用机制和应用前景。,20世纪80年代，由瑞典科学家Boman研究小组用蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)诱导惜古比天蚕(Hyalophora cecropia)后产生了抗菌多肽类物质，随后发现了第一个抗菌肽天
2、蚕素(cecropins)。人们最初把这类具有抗菌活性的多肽称为“antibacterial peptides”,原意为“抗细菌肽”；后来发现其有抗真菌等微生物的作用，便改称为“antimicrobial peptides”,意为“抗微生物肽”。,抗菌肽是由基因编码在核糖体内合成的多肽，不同种类的抗菌肽通常有共同的特点：短肽(3060个氨基酸),强阳离子性(等电点范围为8.910.7),热稳定性好(100 ,15 min)，分子质量约为4 ku，无药物屏蔽且不影响真核细胞。当今，抗菌肽已经可以由原核生物到人类的大部分有机生物体中成功分离和分类。抗菌肽通常作用于细菌，在真核生物的天然免疫方面发挥
3、着重要作用，被认为是古代进化中哺乳动物体内有效保留的免疫分子。,2、抗菌肽的来源,抗菌肽根据其来源的不同通常可以分为4大类，分别为来源于昆虫、动物、微生物基因工程菌的抗菌肽以及人工合成的抗菌肽。迄今为止，已有1 500多种不同来源的抗菌肽被相继报道。,2.1 来源于昆虫的抗菌肽,1.cecropins：cecropins是在天蚕蛹的血淋巴中发现的，它是世界上第一个被发现的抗菌肽。 2. 防御素：防御素有富含半胱氨酸的阳离子结构，是具有3个或者4个二硫键的独特结构的多肽。防御素已从哺乳动物、昆虫和植物中分离出来，它们作为先天免疫效应分子，对病原体感染提供了最初的有效防御。,3. 富含甘氨酸的抗菌
4、肽：迄今为止，许多抗菌肽已经在不同的昆虫中被证实，如：肌毒素(creatoxin)、attacins、双翅杀菌肽(diptericins)和鞘翅杀菌肽(coleoptericins)等。这些抗菌肽都富含14%22%的甘氨酸残基，并且这些残基对肽链的三级结构有重要影响。富含甘氨酸的抗菌肽家族通常可以抗真菌和革兰氏阴性细菌，以及通过破坏细胞膜来抗癌细胞。,4.富含脯氨酸的抗菌肽：富含脯氨酸的抗菌肽是从哺乳动物和昆虫体中分离出来的，主要是抗革兰氏阴性细菌，包括某些植物半生细菌和一些人类病原体。,2.2 来源于动物的抗菌肽,抗菌肽起初是在无脊椎动物动物中发现的，随后在脊椎动物中也有发现，这些肽显示出多
5、样的序列结构和特异性的靶标。基因编码的抗菌肽能够在哺乳动物、两栖动物、鱼类、昆虫等多种不同生物体的组织中表达。,2.3 来源于微生物工程菌的抗菌肽,由于长期使用抗生素导致耐药性菌株增多，人类需要寻找一种新型的抗菌剂。抗菌肽有着广谱抗菌活性，能快速杀死作用靶标，它最有希望成为传统抗菌素的替代品。但是实际生产中应用抗菌肽还有一定的问题，最主要是昂贵的生产成本限制了抗菌肽的应用。利用基因工程重组技术异源表达系统来生产抗菌肽是一种新模式。其中，大肠杆菌是生产抗菌肽良好的表达系统，但是这种小肽很难在这种高水平工程菌株中表达，特别是遇到毒肽类时，会对宿主菌有杀伤作用。最近有人开发利用甲基毕赤酵母表达系统来
6、大规模表达不同来源的蛋白质，有良好的表达效果。,2.4 来源于人工合成的抗菌肽,近年来，随着人们对抗菌肽研究的深入，科研人员尝试人工合成抗菌肽，并在医疗应用方面取得了一定的成果。利用抗菌肽研制的药物已进入市场，如：美国马盖宁制药公司研发出来的马盖宁(magainin)药物可杀死病毒和肿瘤细胞，柞蚕抗菌肽能抑制乙型肝炎和杀灭肿瘤细胞，在医药上已制成肾肝宁胶囊治疗肾炎及肝炎等。,3、抗菌肽的结构,抗菌肽依其结构可分为多种类型，其中Cathelicidin和Defensin为主要的类型；可将其分为5类： (1)单链无半胱氨酸残基的-螺旋，或由无规卷曲连接的两段-螺旋组成的肽； (2)富含某些氨基酸残
7、基但不含半胱氨酸残基的抗菌肽； (3)含1个二硫键的抗菌多肽；,(4)有2个或2个以上二硫键、具有-折叠结构的抗菌肽； (5)由其它已知功能的较大的多肽衍生而来的具有抗菌活性的肽。其中最早分离到的Cecropins和从非洲爪蟾中分离到的Magainins等属于第一类抗菌肽，通常也将其称为Cecropin类抗菌肽，目前对此类抗菌肽的研究也较深入。,4、抗菌肽的作用机制,抗菌肽的确切作用机制目前还在深入研究中，研究人员提出多种理论假设来解释抗菌肽抑制或杀灭微生物的过程。但是抗菌肽的抗菌机制研究只针对个别几种抗菌肽，所以目前还没有一个能够涵盖所有种类抗菌肽作用机理的假说，且不确定哪种假说更接近真实情
8、况。,4.1 抗菌肽与细胞膜的相互作用,抗菌肽能够与细胞膜表面相互作用，使膜的通透性改变。阳离子抗菌肽的正电荷区域与细胞膜上的负电荷区域相互作用，使抗菌肽分子的疏水端插入细胞膜的脂质膜中，进而改变脂质膜结构。抗菌肽与细胞膜作用后形成跨膜电位，打破酸碱平衡，影响渗透压平衡，抑制呼吸作用，总之抗菌肽与膜的相互作用直接关系到抗菌肽的抗菌活性。,如图所示，目前，常用的至少有4个模型来描述抗菌肽的作用机制。A为聚集体模型(aggregate channel)，即抗菌肽与细胞膜上的磷脂分子结合成复合物，一旦复合物崩溃，抗菌肽就进入到细胞内，细胞膜也因受到弯曲张力导致细胞死亡。,B为环孔模型(toroida
9、l)，认为聚集的抗菌肽分子是垂直嵌入到细胞膜上，其疏水区的位移可以使细胞膜疏水中心形成裂口，引发磷脂单分子层向内弯曲，形成一个直径为12 nm的环孔。,C为桶板模型(barrel-stave)，有研究人员指出结合于细胞膜表面的抗菌肽相互聚集，以多聚体的形式插入细胞膜双分子层中，因而形成一个跨膜离子通道。离子通道的形成使外界的水分子和离子等可以渗入到细胞内部，细胞质也可以外流。严重时细胞膜会崩裂导致细胞死亡。,D为地毯模型(carpet-like)，抗菌肽先是平行排列在细胞膜上，当数量达到一定程度时就像地毯一样覆盖在膜表面，以“去垢剂”的作用方式破坏细胞膜而引起细胞死亡。此模型中，地毯模型无需抗
10、菌肽的特殊结构，也无需形成孔道，但抗菌肽的正电荷需要分布于多肽全长，且在整个过程中抗菌肽始终与脂质头端作用而无多肽垂直重排过程。,4.2 抗菌肽干扰靶标的能力,抗菌肽除了作用于细胞膜，还可以作用于细胞内的其他靶标。抗菌肽在进入细胞之后，通过与细胞内靶标的特异性结合干扰细胞代谢，达到抑制和杀灭细菌的目的。此理论解释了许多抗菌肽在非常低的浓度下仍然能够导致细菌死亡的现象。,抗菌肽主要通过以下几个方面在细胞内发挥作用： 1)与细胞内的酸性物质结合，阻断DNA复制和RNA合成； 2)影响蛋白质的合成； 3)抑制细胞壁的合成，阻碍细胞分裂； 4)抑制细胞内酶活性等。,5、抗菌肽的抗病毒活性,抗菌肽作为一
11、种结构简单但功能多样、广谱抗菌、抗病毒的分子,其作用机制也十分复杂,同一种分子可能有多种机制,但抗菌肽的抗病毒机制目前尚不清楚。多数抗菌肽对包膜病毒的灭活作用高于无包膜病毒,这似乎提示抗菌肽通过作用于病毒外壳和核壳体之间的磷脂被膜来影响其活性。,抗菌肽对磷脂被膜的影响在细菌上取得了一定进展,杀菌肽A结合到大肠杆菌(Escherichiacoli)膜上以后,在电子显微镜下可以观察到杀菌肽A在大肠杆菌的膜上形成一个直径9.6 nm的病灶和直径4.2 nm的孔洞,并导致细胞内容物外流。但各种包膜病毒对抗菌肽HNP-1的敏感性相差1 000倍,似乎又说明抗菌肽的作用不完全取决于病毒的包膜。,另外,病毒
12、包膜来自于宿主细胞的质膜,而宿主(真核生物)的质膜对抗菌肽具有很强的抵抗力,病毒对抗菌肽的敏感性可能是因为病毒包膜上存在的病毒蛋白或外源性磷脂酰丝氨酸改变了其性质,同时也不能排除抗菌肽与病毒外壳蛋白的直接作用。,此外,在对Dermaseptin S4、defensins和apolipopro-teins的研究表明,抗菌肽对病毒的作用发生在病毒粒子与宿主细胞融合之前,可能是由于抗菌肽与病毒细胞表面的磷脂结合,从而阻止病毒粒子与宿主细胞的融合。另一种推测是抗菌肽与病毒表面起接触融合作用的糖蛋白或宿主细胞表面的硫酸乙酰肝素葡糖胺聚糖(HS)结合,从而阻止病毒粒子与宿主细胞的融合。,抗菌肽抑制病毒的另
13、一种可能机制是抑制病毒基因的表达。Wachinger等用HIV-1体外感染T细胞和成纤维细胞,然后用蜂毒素在亚毒性浓度下处理细胞,结果显示,HIV-1的基因mRNA和HIV长末端重复序列(HIV LTR)的转录活性被抑制。表明这类抗菌肽不是通过降解细胞质膜或病毒被膜来显示抗病毒活性的。,蜂毒素和天蚕素仅降低HIV基因表达水平,而不影响宿主细胞的看家基因PBGD的表达以及SV40早期启动子的转录活性。这表明蜂毒素可以选择性地抑制HIV基因的表达。作为膜活性肽,蜂毒素可以通过多种渠道影响细胞跨膜信号转导过程,如激活磷脂酶A2、降低钙调蛋白和蛋白激酶C的活性,进而改变HIV转录刺激因子的活性和平衡,
14、或引发类似干扰素对HIV的抑制机制。,另外,蜂毒素还可能参与HIV基因转录后的调控,因为在Wachinger等4的试验中,较大和中等分子mRNA的量远小于小分子mRNA的量。抗菌肽还可能通过模拟病毒的侵染过程发挥作用,如蜂毒素及其类似物的结构与烟草花叶病毒衣壳蛋白的部分氨基酸序列有较高的相似性,而这部分序列在病毒颗粒组装中与RNA和蛋白质结合密切相关,这使得蜂毒蛋白分子可以与病毒包被蛋白在与RNA结合过程中竞争,导致与其结合的RNA构象的改变,从而不能与正常蛋白质结合,病毒颗粒无法正常组装。,6、抗菌肽对病毒的效价和副作用,抗菌肽的功能是多方面的,在我们所需的功能方面不一定有最理想的效价,还可
15、能有细胞毒性等副作用,这需要对分子进行适当的修饰以提高其效价、降低或消除副作用。 蜂毒素有2个规则的双螺旋,分别由211残基和1326残基组成。残基11、12将2个螺旋交联在一起。,如果用能加强双螺旋功能的氨基酸取代原有氨基酸,如用Ala取代Pro,肽的活性则被加强了。如果组成双螺旋区域的残基缺失,它的溶胞作用就会减弱,而如果交联区域的残基缺失的话,肽的溶胞作用则几乎消失。再如用计算机模拟技术以抗菌肽天蚕素B为蓝本,在不改变二级结构的前提下合成了一个与一级结构相差60%的shival。,结果发现,与天蚕素B相比,shival的抗菌活力比天蚕素B更强,作用范围更广,而对未受侵染的宿主细胞无伤害。这提示具有抗病毒性质的抗菌肽也可以通过各种修饰作用来改变其抗病毒效价。这预示着天然抗菌肽在某些方面可能存在着很大的被改造加工的潜力。因此设计并改造天然抗菌肽是新型抗菌肽开发的重要方向。,The End,
