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1、浙江大学医学院 博士学位论文 大蒜素对高糖环境人肾小管上皮细胞转分化和凋亡的抑制作用 及其机制研究 姓名：黄虹 申请学位级别：博士 专业：内科学 指导教师：李红 20100501 浙江人学博十学位论文中文摘要 大蒜素对高糖环境人肾小管上皮细胞转分化和凋亡的抑制作 用及机制研究 浙江大学医学院 博士研究生： 博士生导师： 研究背景 中文摘要 内分泌专业 黄虹 李红教授 糖尿病肾病是糖尿病常见和严重的慢性并发症之一，也是导致终末期肾病的 主要原因之一。糖尿病肾病的发病机制尚未完全阐明。近年研究表明，肾小管间 质病变是糖尿病肾病发生发展的关键因素之一，进一步深入研究肾小管间质病变 的分子机制、寻找有
2、效治疗的新靶点，对预防和延缓糖尿病肾病的发生发展有重 要意义。 肾小管间质纤维化的过程包括肾小管的萎缩和消失、肌成纤维细胞的聚积和 细胞外基质的沉积。目前认为肾间质细胞外基质主要由肌成纤维细胞产生，但有 证据表明，在一些病理条件下，肾小管上皮细胞可发生上皮细胞肌成纤维细胞转 分化( T u b u l a re p i t h e l i a lm y o f i b r o b l a s tt r a n s d i f f e r e n t i a t i o n ，T E M T ) ，即肾小管上皮 细胞丧失原有的上皮细胞表型特征，获得肌成纤维细胞的表型，大量表达肌成纤 维细胞的标志
3、性蛋白小平滑肌肌动蛋白( O 【S M A ) 和波形蛋白( V i m e n t i n ) 。已有 众多的研究表明，肾小管上皮细胞转分化直接参与肾间质纤维化的进程，是肾间 质纤维化发生、发展的的中心环节，已成为肾纤维化乃至慢性肾功能衰竭的重要 I I 浙江大学博J ? 学位论文 中文摘要 机制之一。 T G F D l 是具有多种重要生物学作用的生长因子，也是目前已知的诱导肾小管 上皮细胞转分化作用最强的生长因子，除S m a d s 通路外，尚可通过不同信号传导途 径产生多种生物学效应，在肾小管间质纤维化中发挥了核心作用。M A P K 信号通路 是非S m a d s 依赖途径中的重
4、要通路之一，它是广泛存在于细胞内的信号转导途径， 由丝氨酸苏氨酸蛋白激酶组成。在M A P K 家族中，细胞外调节激酶( E R K ) 是最 早被发现的成员，它包括两种异构体E R K I 和E R K 2 。有研究提示，E R K 信号通路是 细胞信号中传递丝裂原信号的关键激酶，与肾小管上皮细胞转分化和肾脏纤维化 密切相关。关于高糖环境下人近端肾小管上皮细胞发生转分化是否与T G F D 1 E R K 信号通路有关，目前较少报道。 细胞凋亡与增殖的动态平衡是多细胞生物维系结构完整和内环境稳定的基本 生物学特性。随着对细胞凋亡的基因调控、信号转导及其与疾病关系的深入研究， 表明细胞凋亡密切
5、参与了糖尿病肾病的发生机制。研究发现，在糖尿病肾病早期 即出现肾小管上皮细胞的凋亡，后者是导致肾小管功能障碍的重要原因之一，也 是糖尿病肾病进展为慢性肾功能衰竭的重要机制之一。有研究显示，肾小管间质 纤维化形成中存在明显的肾小管上皮细胞凋亡现象，病变早期凋亡细胞数随着肾 间质纤维化的加重呈明显增高趋势。因此在糖尿病肾病致肾小管间质纤维化的发 生发展过程中，肾小管上皮细胞凋亡是高血糖损伤肾小管上皮细胞的重要病理变 化形式之一。 大蒜素，是大蒜的主要有效成分。现代化学和药理学研究发现大蒜素具有抗 菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、提高机体免疫力等多方面的作用。近年 研究表明，大蒜素有抗肺、肝及心
6、肌纤维化作用，主要与其抑制成纤维细胞增殖， 抑制促纤维化因子的分泌及减少细胞外基质的合成等有关。另有研究发现，大蒜 素可抑制创伤失血性休克大鼠重要脏器的细胞凋亡。但大蒜素是否具有抑制高糖 诱导肾小管上皮细胞转分化和凋亡的作用，目前尚未明确。 I I I 浙江大学博士学位论文 中文摘要 研究目的 1 观察大蒜素对高糖环境下入近端肾小管上皮细胞转分化的作用，并初步探讨大 蒜素抑制肾小管上皮细胞转分化的机制。 2 观察大蒜素对高糖环境下人近端肾小管上皮细胞凋亡及凋亡相关蛋白B c l 2 和 B a x 表达的影响，并初步探讨大蒜素抑制肾小管上皮细胞凋亡的机制。 实验方法 1 以人肾小管上皮细胞株H
7、 K 2 细胞为研究对象，按实验条件分为4 组，以D M E M 为培养基，即正常糖对照组( 低糖5 5 m m o l f lD M E M ) 、高糖组( 高糖2 5 m m o l 1 D M E M ) 、大蒜素组( 高糖组加不同终浓度的大蒜素，剂量分别为2 5 、5 、1 0 、2 0 u g m 1 ) 和E R K 抑制剂组( 高糖组加2 0 u m o l lP D 9 8 0 5 9 ) ，分别培养2 4 h 、4 8 h 。采 用免疫细胞化学法、荧光免疫细胞化学法检测各组细胞内0 【S M A 、V i m e n t i n 和 C o l l a g e nI 的相对表
8、达量，R e a l t i m eP C R 法检测各组细胞T G F B 1m R N A 的相对表 达，W e s t e mB l o t 法检测各组细胞T G F B 1 、p - E R K l 2 ( 磷酸化的E R K l 2 ) 蛋白的相 对表达。 2 以人肾小管上皮细胞株H K 2 细胞为研究对象，按实验条件分为3 组，以D M E M 为培养基，即正常糖对照组( 低糖5 5 m m o l lD M E M ) 、高糖组( 高糖2 5 m m o l 1 D M E M ) 和大蒜素组( 高糖组加不同终浓度的大蒜素，剂量分别为2 5 、5 、1 0 、 2 0 u g m
9、 1 ) ，细胞培养2 4 h 、4 8 h 。采用流式细胞术观察各组细胞的凋亡率，采用免 疫细胞化学法检测H K 2 细胞l 勾B c l 2 和B a x 蛋白的相对表达量。 3 应用S P S S1 3 0 统计软件对数据进行分析，计量资料用均数4 - 标准差( X 士S ) 表示， 各组间比较采用单因素方差分析( o n e w a yA N O V A ) ，计数资料用率( ) 表示， 各组间比较采用) 【2 检验，p 0 0 5 有统计学意义。 I V 中文摘要 结果 1 大蒜素对H K 2 细胞形态学变化的影响 正常糖对照组生长2 4 h 后，形成融合的单层细胞，呈椭圆形或者多边
10、形贴壁细 胞，生长4 8 h 后细胞间紧密连接，具有典型的上皮细胞铺路石样形态学特征。高糖 组生长2 4 h 后，细胞形态改变不明显，生长4 8 h 后，可见部分细胞发生明显的形态 学改变，表现为成纤维细胞样外观：细胞拉长、肥大，呈长梭形，由椭圆形贴壁 生长变为长梭形，丧失其铺路石样生长方式。大蒜素组( H + A 2 0 u g m 1 ) 干预4 8 小时 后，细胞形态与N 组无明显差异，光镜下多数细胞保持正常上皮，仅少数发生形态 变化。P D 9 8 0 5 9 组细胞生长4 8 h 后，受高糖刺激而出现的形态学改变有一定程度的 改善。 2 大蒜素对H K 2 细胞0 c S M A 、
11、V i m e n t i n 、C o l l a g e nI 表达的影响 细胞培养4 8 h ，高糖组0 c S M A 、V i m e n t i n 、C o l l a g e nI 表达的积分光密度值( I O D ) 较正常糖对照组明显增加，均有统计学意义p 0 0 1 ) ；P D 9 8 0 5 9 组o t - S M A 、V i m e n t i n 和C o l l a g e n I 表达I O D 较高糖组均明显减少p 0 0 1 ) ，且与正常糖对照组无明显差 异( 矿O 0 5 ) ；高糖环境下经不同浓度的大蒜素( 2 5 、5 、1 0 、2 0 u
12、g m L ) 干预后， S M A 、V i m e n t i n 、C o l l a g e nI 表达N I O D 明显下降，并呈浓度依赖性，尤t ) j , 2 0 u g m L 更为明显( p 0 0 5 ) 。 3 大蒜素对H K 2 细胞T G F p l m I 矾A 表达的影响 细胞培养4 8 h 时，与正常糖对照组比较，高糖组H K 2 细胞T G F 3 1 m R N A 表达明 显上调p 0 0 5 ) ；P D 9 8 0 5 9 组可逆转高糖刺激下T G F - p 1m R N A 表达p 0 0 5 ) ，但 仍高于正常糖对照组p o 0 5 ) ；大
13、蒜素可明显下调高糖刺激T H K - 2 细胞T G F 一1 3 1 m R N A 的表达，并呈浓度依赖效应，尤其在1 0 u g r n l 、2 0 u g m l 时( p O 0 5 ) ，同时与 P D 9 8 0 5 9 组比较无显著性差异，且2 0 u g m l 时与正常糖对照组比较亦无显著性差异。 4 大蒜素对H K 2 细胞T G F 1 3 1 、p - E R K1 2 蛋白表达的影响 细胞培养4 8 h 时，正常糖对照组H K 2 细胞可见少量T G F 1 3 1 、p - E R K1 2 蛋白的 表达；高糖组H K 2 细胞T G F 1 3 1 、p E
14、R K1 2 的蛋白表达较正常糖对照组明显上调 V 浙江大学博上学位论文中文摘要 ( 胙0 0 5 ) ；与高糖组比较，P D 9 8 0 5 9 组T G F 一1 3 1 、p - E R K1 2 蛋白表达均明显下调 p 0 0 5 ) ；与高糖组比 较，经不同浓度大蒜素( 2 5 、5 、1 0 、2 0 u g m L ) 干预4 8 “ 时后，H K 2 细胞T G F p 1 、 p - E R K1 2 蛋白的表达水平均呈药物浓度依赖性下调p O 0 5 ) ，尤以2 0 u g m L 浓度作 用最强，抑制率分别为5 5 7 ( T G F 一1 3 1 ，p 0 0 5 )
15、 和3 7 7 ( p - E R K1 1 2 ，p 0 0 5 ) ， 且与正常糖对照组比较，p - E R K1 1 2 蛋白表达亦明显下调，而T G F B 1 蛋白表达差异 无显著性，但两者均仍高于P D 9 8 0 5 9 组( p 0 0 5 ) 。 5 大蒜素对H K 一2 细胞凋亡率的影响 细胞培养2 4 h ，正常糖对照组只有少量细胞发生凋亡，凋亡率仅为( 6 5 6 士1 0 9 ) ，而高糖组凋亡率为( 1 6 2 5 士0 5 8 ) ，两组间有显著性差异( p 0 0 1 ) ；大蒜 素干预组( 2 5 、5 、1 0 、2 0 u g m L ) 的细胞凋亡率分别
16、为( 1 2 5 4 士2 2 1 ) 、( 9 2 1 士2 8 5 ) 、( 8 5 3 士2 1 5 ) 、( 6 8 1 4 - 0 9 2 ) ，均较高糖组有明显下降( 2 5 u g m L NP 0 0 5 ， 5 、1 0 、2 0 u g m L Np O 0 5 ) 。细胞培养4 8 h ，正常糖对照组细胞亦只有少量细胞发 生凋亡，凋亡率仅为( 6 8 2 士2 3 8 ) ，高糖组升高为( 2 3 5 3 士3 2 1 ) ；而大蒜素 干预组( 2 5 、5 、1 0 、2 0 u g m L ) 的细胞凋亡率分别为( 1 4 4 3 士1 8 5 ) 、( 11 6 8 士3 2 0 ) 、( 1 0 19 - - 4 - 1 9 3 ) 、 ( 7 9 9 士2 0 0
