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1、中 华 徽 生 物 学和 免 疫 学杂 志2 0 0 1 年4 月 第2 1 卷 增刊 C fi in 1 M ic ro b io l I - d , A p d ) 2 0 0 1 , V o d 2 1 ， S u p p l 变 应 原 实 验 研 究 大籽篙花粉变应原提取液双向电泳 蛋白质组分分析 孙劲旅张宏誉应万涛钱小红 ! 摘要】 目 的 探讨用双向 电泳( T w o d i m e n s io n a l e l e c h o p h -is , 2 - D E ) 对大籽 蓄花 粉提取液蛋白 质组分进行分析的可能性及其实用价值。 方法按常舰方法提取大籽离花粉变应原， 经
2、 S D S - .丙娣 酷胶凝胶电 泳及双向电泳对大籽蓄花粉提取液变应原进行蛋白 质组分分析。 结. 单纯聚丙烯院胺 电泳结果可见有4 个较明显的条带， 分子量 分别为6 2 k D . 5 2 k D , 4 3 k D 和2 5 k D ,经双向电泳蛋白 组分分 析， 发现大籽蔺花粉提取浓有8 5 种蛋白组分。其中， 第1 3 9 点的分子t为3 1 .4 9 0, 等电点为5 . 3 9 ; 第 1 4 3 点的分子f为3 1 . 8 6 k D ， 等电点为6 . 3 8 。这两个点与文献所报道组分 A 2 。 的蛋白质分子I为 3 1 k D等电点分别为5 . 3 和6 . 3 5
3、 -致。 绪论双向电泳对大籽禽花粉提取液蛋白 质组分进行分析具 有实用价值， 并可进一步用于变应原致敬组分的研究。 I 关甘询 】 大籽禽花粉变应原; 双向电泳; 蛋白 质组分分析 T w o山 m e n d a o a l e l a Y rop h o r a i s a n a l y 山 o f p r o t e i n c o m p o n e n t s 加A r t e a r m i a a l l e r g e n e x t r a c t S U N如I . , Z D A N G N m rg y u , M G W a rta a , e t al. D e
4、p a r 7m e n t o f A l ie rg l ， P e k in g U n i o n M M -1 C o lle g e H o s p it a l , Chin- A c a d e m y 了M e d ia l S c i-, T ar o d i m e n s io n a l e l e c tm p h o r e s is ; P ro te i n a n a l y s is 禽属花粉是我国主要的致敏花粉0 1 ， 为深人对 禽属花粉的致敏组分进行研究， 我科 2 ) 曾于1 9 9 2 年 采用硫酸按盐析、 D E A E 纤维家柱及S e p
5、h a d e x - G - 1 0 0 柱层析方法对禽属花粉进行了分离纯化。目前， 双 向电泳是蛋白质研究领域广泛使用的蛋白质分离检 测技术， 它拥有其它方法无法替代的高分辨能力， 现 在正迈向国际标准化， 国外也正在探讨采用双向电 泳对变应原进行分析的可行性i- 1 。迄今为止， 用双 向电泳对大籽禽花粉变应原进行蛋白组分分析， 少 见报道。为探讨聚丙烯酷胺与等电聚焦电泳相结合 的双向电泳对大籽蔺花粉提取液蛋白质组分进行分 析的可能性及其实用价值， 本文对我国华北地区秋 季花粉症的主要致敏物质大籽篙花粉进行双向 作者单位: 1 0 0 7 3 0北京， 中国医学科学院 中国协和医科大学
6、北 京协和医院变态反应科 孙劲旅， 张宏誉)国家生物医学分析中心 ( 性小红 . 应万绪 电泳， 并初步分析其蛋白组分。 材料与方法 1 . 大籽蓄花粉变应顾的握取ta t : 将去 脂大籽蔺 花粉按1 : 2 5 比 例加入C o c a s 液( 抓化钠5 g , 碳酸氢 钠2 . 7 5 8 , 结晶酚4 g ， 加蒸馏水至1 0 0 0 m 1 , p H 8 . 2 ) ， 搅 拌提取7 2 h , 静置0 . 5 h 后， 上清液经直径0 . 2 2 p ，的 滤器过滤， 燕馏水透析， 聚乙二醇浓缩， 使其终浓度 为5 m g l a il以 上 均 在4 进 行。 2 . 电泳
7、( 1 ) 试荆: 3 0 % 丙烯Pk rr ( a c ry l a s n i d e ) I 甲叉双丙烯 跳胺( 3 0 : 0 . 8 , 2 . 7 %C ) 、 甘氨酸( g l y c i n e ) 、 三轻甲基氮 基甲烷( T ri s ) 购 自 B i o - R a d公司，四甲基乙二胺 ( T E M E D ) , C H A P S购自S i g m a公司， 超纯脉( u l t r a u r e a ) , I P G 缓冲液、 L P G 艘盖液、 I P G干胶条( p H二 3 . 5 一l 0和4 一 7 , L =7 c m) 、 低分子量标记物
8、和 P h a rn le - 望堕生 鱼 全 立 鱼 鱼 全 鱼 查 卫 丝 生 4 旦 兰卫 鱼壁 卫 C h i. I M ic m td o l I- . . o l , A y rll 2 0 0 1 , V . 1 2 1 S . u d l y t e ( p H二 3 一 1 0 ) 购自A m e s h a m P h a r m c i a B i o t e c h 公 司， 二硫苏糖醉( D TT) 购自P r o m e g s 公司， 十二烷基磺 酸钠( S D S ) 购自日 本N a c a l a i T e s q u e 公司， 碘乙酞胺 ( i o d
9、 o a c e ta m i d e ) 0 l 自F l u k a 公司， P M S F 购自S i g m a 公 司， 其余均为国产试剂。 ( 2 ) 设备: I P G p h o r , 附件和循环水浴 A m e rs h a m P h a n m a c i a ) ， 垂直电泳仪m i n i V E ( A m e r s h a m P h a ri n c i a ) , I m a g e S c a n n e r 光密度仪( A m e r s h a m P h a r m c i a ) , P e n t i u m l - H徽处理器 ( D e n
10、 ) ， 高速低温离心机( 贺利氏) , 5 5 0 型醉标仪( B i o - R a d ) 。 双向电泳图象分析软件 I m - a g e M a s t e r E li t e 3 . 0 1 ( A m e r s h a m P h a r m c i a ) ( 3 ) 聚丙烯酸胺凝胶电泳: 将制成的大籽禽花粉 变应原提取液以冷丙酮沉淀后进行聚丙烯酞胺凝胶 电泳( S D S - P A G E ) , 1 6 0 V恒压电泳， 固定染色。 ( 4 ) 双向电泳( 6 第一向固相p H 梯度等电聚焦: 取适量样品以 1 : 4 冷丙阴沉淀( 一 。 ) 过夜， 1 2 0 0
11、 0 x g 离心1 0 m i n , 4 C， 弃去丙酮， 凉干， 再加人 R e h 州 r a t io n ( 十 D TT 十 I P G B u ff e r ) 使蛋白全部溶解， 静置 1 h o等电聚焦条 件如表 t o 硝酸银溶液( 含0 . 0 2 %甲醛) 2 0 m i n ; 弃银溶液， 加人 显色液 ( 2 . 5 %无水碳酸钠和 0 . 0 1 % p 醛)3一1 0 m i n ; 最后加人终止液( 1 . 4 6 %乙二胺四乙酸二钠) , 1 0 m i n 后， 终止反应。 银染在2 0 cC 振荡下进行l9 1 3 . 圈象分析: 利用 I m a g
12、e S c a n n e r 光密度仪， 在 3 0 0 d p i 的分辨率下， 对银染的凝胶进行扫描。在 P e n t i u m II 微处理器 ( D e l l ) 下运行， 分析蛋白图谱。 利 用双向电泳图象分析软件的点检侧( s p o t d e te c - t i o n ) ， 背景消减( b a c k g ro u n d s u b t r a c t i o n ) 测得所检测点 的个数。 结果 1 . 大籽，花粉提取液班丙烤陇胺凝胶电泳结 果: 大籽高花粉提取液经单纯聚丙烯酞胺电泳， 有4 个较明显的蛋白条带， 分子量分别为6 2 k D , 5 2 k D
13、 , 4 3 k D和 2 5 k D ( 如图 1 所示) 。 衰1 I F G p b o r 等电.热系 统中.相干胶条I E F ，盆 S e P V o h a s e ( V ) S c e p d m e a m( h ) V o l t h o m e ( V h ) 划期期750 3 0 2 1 5 0 】 1 01 0 S以月 】3 20 01 平衡: 将等电聚焦后的 I P G胶条放人平衡液 ( I . 5 m o 1 1 L T ri s 1 . 3 4 m l , U r e a 1 4 . 1 4 g , G ly cero l 1 2 m 1 , S D S 0
14、. 叱， 痕量澳酚蓝) 4 0 m l 中， 于摇床上振荡 1 5 m in x 2 。其中， 第一种平衡液中 含D TT 2 0 0 m g ， 而第 二种平衡液内由 碘乙 酷胺0 . 9 g 取代。 第二向垂直平板 S D S - P A G E : 根据 I P G c o n v e r - s i o o K i t 的体积， 配制大小为1 0 0 x 1 0 0 x l m m , 1 2 . 5 % 的均匀胶。将平衡后的 I P G胶条移至凝胶的上方， 用0 . 5 %的琼脂特封闭。电泳缓冲液为T ri s - G l y c i n e - S D S ， 在1 4 - 1 5
15、 9 C 时， 以每一胶条1 5 m A 恒流电泳， 直 至澳酚蓝前沿距玻瑞板下缘为止。 染色: 电泳结束后， 待分析的凝胶人固定液 ( 5 0 %无水乙醉、 t o %冰醋酸) ， 至少3 h或过夜; 之 后， 弃固定液， 更换增敏液( 3 0 %无水乙醇, 0 . 2 5 %戊 二醛、 0 ， 2 %硫代硫酸钠, 6 . 8 %无水醋酸钠) 3 0 m i n ; 弃增敏液， 去离子水清洗3 x 5 m i n ; 随后， 加人0 . 1 % 圈1 大籽禽花粉提取液单纯.丙娜民破电泳扫描 2 . 大籽蓄花粉提取液双向电泳蛋白组分分析: 双向电泳见图2 ， 进行计算机扫描和图象分析， 可得
16、知各蛋白 组分的分子量和等电点( 见表2 ) 0我们发 现大籽禽花粉提取液有 8 5 种蛋白组分， 各组分的分 子2和等电点如表2 所示。其中， 第1 3 9 点的分子量 为3 1 . 4 9 k D ， 等电点为5 . 3 9 ; 第 1 4 3点的分子量为 3 1 . 8 6 k D ， 等电点为6 . 3 8 。这两个点与文献 2 ) 所报 道组分A 2 c 的蛋白质分子量为 3 1 k D ， 等电点分别为 5 . 3 和6 . 3 5 是一致的。并且， 双向电泳的计算机扫 描图中， 我们还可以判断其具体的第1 3 9 点和第 1 4 3 点的位置( 如箭头所示) 。 l 翻 中 华 徽 生 物 学和 免 度 学杂 志7 0 0 1 年4 月 第2卷 增刊 C h in 7 M ic . . W . 1 l-.1, A p d 1 2 0 0 1 , V . 2 1 , 5 u p p 1 飞 斑 2 大籽蕊花粉变应砚浸液双向电泳旅胶计x机扫抽 和二 分析后， 各班白组分的分子.和等电点 Sp o t Vo l
