《固定ph梯度毛细管等电聚焦测定大肠杆菌等电点》由会员分享，可在线阅读，更多相关《固定ph梯度毛细管等电聚焦测定大肠杆菌等电点（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第十七届全国色谱学术报告会及仪器展览会会议论文集 o C 0 0 4 固定p H 梯度毛细管等电聚焦测定大肠杆菌等电点幸 蔡波太屈锋” ( 北京理】j 大学生命科学与技术学院，北京1 0 0 0 8 1 ) 微生物在不同生长时期表面蛋向质的种类及数量的变化导致其表面电荷的变化，研究微生物细 胞表面的等电点对于微生物的的生理生化研究具有重要意义。毛细管电泳是高分辨率的分离分析技 术，其在微生物的应| 咐研究近年取得了较人进展 1 4 1 。毛细管等电聚焦通过在自由溶液中添加两性电 解质形成p H 梯度，使不同等电点的微生物聚集在相虑的等电点位置，从而达剑分离目的。由于两 性电解质具有较强的背景紫
2、外吸收，造成微生物检测灵敏度较低，故使用自由溶液毛细管等电聚焦 通常只能选择2 8 0 n m 作为检测波长【5 】。本文通过在毛细管内壁形成同定的p H 梯度，避免背景两性 电解质的强紫外吸收，在2 1 4 n m 检测明显提高了毛细管等电聚焦检测大肠杆菌的灵敏度，初步建立 了同定p H 梯度毛细管等电聚焦检测人肠杆菌等电点的方法。 关键词：毛细管等电聚焦，I 司定p H 梯度，大肠杆菌，等电点 1 实验部分 1 1 仪器与试剂 A g i l e n t 毛细管电泳仪G 1 6 0 0 A X ，熔融石英毛细管( 河北永年锐阳色谱器件有限公司，1 0 0um i d x 3 7 5 9 m
3、 ) ，载体两性电解质A m p h o l i n e ( p H 3 5 - 1 0 0 ，P h a r m a c i a ) ，异氰酸酯( S i g m a ) ，大肠杆菌J M 8 3 A m p 抗性菌株( 爱丁堡人学提供) ，去离子水，其它试剂均为分析纯。 1 2 异氰酸酯固定化p H 梯度的制备 同定p H 梯度方法采J j 文献【6 J 报道方法。 1 3 样品迁移速度测定 制各好的l 青I 定化p H 梯度毛细管长3 8 5 c m ( 出口距检测窗口8 5 c m ) ，用2 0 m M 磷酸盐缓冲液 ( p H 7 0 ) 缓冲液冲洗毛细管直至基线平稳，在5 0 m
4、 b a r 压力下推入样品溶液，从产生压力开始计时至 出现平台峰结束，记录所刚时间即为样品溶液在5 0 m b a r 压力下迁移3 0 c m 所用时间。 1 4 固定p H 梯度毛细管等电聚焦 ( 1 ) 样品制备 大肠杆菌培养1 8 h 后取l m l 培养液( 经涂布平板测得菌体浓度为1 0 8 个m l 数量级) ，3 4 0 0 r p m 离心6 m i n ，将沉淀重新悬浮丁去离子水中。按上述方法州之离子水清洗菌体两遍，将清洗后的大肠 杆菌悬浮Tl m l 、2 0 m M 磷酸盐缓冲液( p 1 1 7 0 ) 中。州2 0 m M 磷酸盐缓冲液( p H 7 0 ) 稀释
5、1 0 0 0 倍后混匀 待川，菌体浓度在1 0 j 个m l 数量级。 ( 2 ) 等电聚焦条件 阴极缓冲溶液为2 0 m MN a O H ，同I 极缓冲溶液为2 0 r a MH 1 P 0 4 ，电泳缓冲液为2 0 m M 磷酸盐缓 冲液( p H 7 0 ) 。川磷酸盐缓冲液平衡毛细管柱1 小时以上，用手动泵将样品注满其中，聚焦1 0 m i n 后， 在5 0 m b a r 压力I - t t I 出样品溶液进行检测。 1 5 自由溶液聚焦确定大肠杆菌等电点 罔家自然科学綦会( 2 0 8 7 5 0 0 9 ) 固家点牡础f J f 究发腱计划( 2 0 0 7 C B 9 1
6、 4 1 0 1 ) 资助项目 ”通讯联系人，屈锋，E m a i l ：q u f c n g q u r 窖b i t e d u c a 2 0 l 第十七届全国色谱学术报告会及仪器展览会会议论文集 利片j 自由溶液聚焦确定样品等电点范围。微生物样品制备过程同1 41 。在样品溶液中加入4 两性屯解质溶液，将样品溶液注A 另一根长度为5 2 c m 的束活化毛细管。等电聚焦1 0 m i n 后取出毛细 管，p H 梯度与毛细管睦度的对应关系如酗1 。分段剪切毛细管，吹出各段毛细管内的溶液通过涂布 平板检测，判断聚焦后的人肠杆菌在毛细管内的位置，确定其等电点的D H 范围， *0 481
7、21 62 02 42 8 3 2M4 0 4 4 4 8 女 “”i j ：j ；0 ：；：j ；_ 一 日H m 3 544 555 566577 588 59 95 1 0 围I 成的p H 梯度与毛细管长度的对麻关系 2 结果与讨论 21 固定p H 梯度毛细管等电聚焦条件的选择 p H 聚焦电压过大会产生较大的电流和焦耳热，使分离效率降低。微生物浓度过大会造成毛细管 堵塞。毛细管度影响样品聚焦过程中的迁移距离和聚焦完成时间。本实验确定的优化聚焦条件为 聚焦电压1 5 K V ，阴极缓冲溶液为2 0 m tN a 0 H ，刚极缓冲溶液为2 0 删H 3 P 0 4 ，电泳缓冲渡为2
8、0 m M 磷酸 盐缓冲液( p H 70 ) ，聚焦时间1 0 _ l l i n 微生物样品浓度约1 0 - 个菌体m ，毛细管长度为3 85 c m 。 2 2 样品移动速度计算 在5 0 m b a r 压力下将样品推入毛细管，从产生压力开始计时直到基线开始上扬，共用时3l m i n ( 1 17 m i n 至1 48 m i n ) ，说明此压力r ，样品通过3 0 c a 长的毛细管需时3l m n 。即样品移动速度 为96 8 c m m i n 。 2 3 固定p H 梯度毛细管等电聚焦大肠杆菌 聚焦1 0 m ir l 后用5 0 m b a r 压力推山管内溶液，在1
9、12 r a i n 时出现大肠杆菌峰( 图2 ) ，则大肠杆 菌峰距离检测窗口为 2 r a i n 所麻迁移的距离。由2 2 中样品迁移速度可得大肠杆菌峰距检测窗口距 离为1 16 2 c m ，由u 丁3 85 c m 长毛细管对麻的p H 梯度为3 5 1 0 则太肠杆菌在该处对戍的菩电点为6 5 。 2 1 4 r i m 检测的灵敏度明显高于2 8 0 n m 的检测。 圈2l 目定化p H 梯崖聚伟人肠杆苗叱泳幽 2 4 固定p H 梯度确定大肠杆菌等电点 往5 2 c mK 的毛细管中形成351 0 的州梯度，! _ ! l J 每4 c m 小段对戍的l 跨度山05 个p H
10、 。在符 段吹出的人肠杆菌样M 溶液。 ，对麻的等。b 点为6 7 段的人肠科菌样铺溶液经涂和平扳检测出人世 菌落生K 初步! | 盘证r 测定结果。 参考文献 D a n i e l WA 丌1 l s t r o n gG c o r gS c h u l t eJ e f f r e y M “a l4 n “c 托m1 9 9 97 I ：5 4 6 5 5 4 6 9 第十七届全国色谱学术报告会及仪器展览会会议论文集 C h a r l i eM e e r t ，A m yG u o ，e ta 1 ，C h r o m a t o g r a p h i a ，2 0 0 7 ，
11、6 6 ：9 6 3 - 9 6 8 F i l i pR u z i c k a ，M a r i eH o r k a ，e ta 1 ，J o u r n a lo f M i c r o b i o l o g i c a lM e t h o d s ，2 0 0 7 ，6 8 ：5 3 0 - 5 3 5 M a r i eH o r k a , F i l i pR u z i c k a , e ta 1 ，J o u r n a lo f C h r o m a t o g r a p h yE2 0 0 6 ，8 4 1 ：15 2 - 15 9 Y u f e n gS h e n ，S c o RJB e r g e r ，G o r d o nA A n d e r S o ne ta 1 ，A n a lC h e m ，2 0 0 0 ，7 2 ：215 4 谢瑶，尹开吉，罗爱芹，屈锋，邓玉林。分析诃复妇参2 0 0 7 ，2 6 ( 6 ) ：2 5 2 8 2 0 3 吲州吲吲
