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1、佳木斯大学 硕士学位论文 双腔循环宫腔冲洗法获取早孕胎儿滋养细胞方法研究 姓名：吕敬媛 申请学位级别：硕士 专业：病理与病理生理学 指导教师：王淑秋;卢北燕 20030601 中文摘嚣鑫嚣人接率请颡士矫霞生姥交 一、中文摘要 嚣戆；探索一辩逶藿通：挚旱蘩产蕊渗鼗懿、安垒：麟露鹣获警潞j L 臻鞋 的取样方法。 方法；l 、菇签缀耱疆环窝蓉冷淡罄，甏拟霞天王滤产懿媳铤草擎辩李亍 循环予宫腔冲洗，研究获取骀几滋养细胞的情况麓取样甜间，并与骝 键蕈疑砖浚謦榉涔避嚣E 较。2 、对获取熬滋养缭稳行免疫缀证鉴定。3 、 对攒予药物流产的早窜粥行循环予富臃冲洗，探索取祥襟 睾对孕鲻激胎 j L 稳缀麓影确
2、。 绪栗：藏腔薅环窝蕴渖洗法诧苹靛冲洗法瀚牧韵液体量多，获取滋器缅 黪戆辍| 数离( 7 3 潞，4 4 瀚p 匿壤淡漆量寒予警逶遒；中洗维( 缝) P O 0 5 。这可能与合体滋养细胞形态特点明显有关。表明用双 腔管循环宫腔下段冲洗取样合体滋养细胞获取率可达7 0 以上。 讨论在职人员申请硕士研究生论文 七、讨论 一、滋养细胞脱落机理 滋养细胞脱落进入宫腔及宫颈中的机理至今尚未完全阐明。从胚胎 发育来看，于受精后第5 天，在囊胚周围的外层细胞形成了滋养层细胞 的始基，约在受精第九天，滋养层细胞开始分化为复层，内层为细胞滋 养层，外层为多核的合体滋养层。合体滋养层穿透子宫内膜的基底膜后 进入
3、间充质，获取足够的营养，使滋养层很陕发育。约在受精后1 2 天， 囊胚植入完成，子宫内膜迅速发生蜕膜变，孕卵被埋在肥厚的蜕膜层内。 受精后第2 周，滋养层表面形成了放射状的指状绒毛突起，至受精后第 3 周，胚胎外观象一个毛绒绒的球。随后，绒毛继续增多，直至受精后 第8 周。随着妊娠的进展，胚泡逐渐凸向宫腔。包蜕膜高度伸展，血液 供应缺乏，包蜕膜明显变薄。包蜕膜下的绒毛也因缺乏血液供应逐渐萎 缩，至妊娠1 4 1 5 周时绒毛消失，形成滑泽绒毛膜。而与底蜕膜接触的 绒毛则继续增殖形成叶状绒毛膜，与底蜕膜共同构成胎盘。约在妊娠1 2 周羊膜腔增大，包蜕膜与壁蜕膜相贴，最终融合在起无法分离。 目前分
4、析认为滋养细胞到达宫腔有两种可能：( 1 ) 随着胎囊增 大，包蜕膜缺乏血液供应，导致组织脆弱而脱落。( 2 ) 滋养细胞具 有侵袭力，可穿透包蜕膜到达宫腔。因此，从理论上讲滋养细胞脱 落于宫腔是可能的，前期研究也表明在子宫腔可获取滋养细胞，并 且这些细胞还具有一定的活力”。 二、 取材部位及方法的选择 脱落于宫腔的滋养细胞在子宫腔下部聚集并可进入宫颈及阴 道，因此经生殖道获取胎儿细胞，可取材部位有阴道穹窿、子宫颈 管和子宫腔下段。G r i f f i t h 一： o n e s ( 1 9 9 2 ) 。”在三个部位取材研究 表明，阴道和富颈滋养细胞数少，受精子污染机会较多，子宫腔下 部
5、是胎儿细胞的可行性来源。白求恩医科大学通过实验在孕妇生殖 道中三个部位取样所进行的组织形态学观察，更确切表明子宫腔下 段较阴道穹窿和宫颈管存在合体滋养细胞数多，获得阳性细胞率 高，p O 0 5 ，有显著差异。可见在生殖道取样行产前诊断的理想 讨论 A - 职人员申请顺i + 研究生论文 部位是子宫腔下段。 在子宫腔下段取标本的方法有两种：l _ 拭子取样法：即用消 毒棉拭子在阴道、宫颈管或子宫腔下段取样。拭子法的优势在于操 作方便，进入宫腔取样时，仅接触子宫腔下段，不侵扰胚胎。白求 恩医科大学设计并研制了专用于宫腔下段的取样工具一套管拭子， 采用套管拭子在子宫腔下段取样，不仅取材成功率较高，
6、而且还克 服了普通棉拭子取样易造成精液污染问题。因此套管拭子为一种较 好的取样工具，但获取的细胞量较少。2 冲洗取样法：冲洗器多是 研究者自行设计的。R h i n e 采用的抽吸仪有一个2 5m 外径的塑料 管，其中有活塞及侧臂用来冲吸宫颈标本。B a h a d oS i n g h 。”1 采用的 是一个改进的C V S 导管，头钝以免损伤胎盘，一边近端有- - d , 孑L 以 便冲吸。在超声指导下，将该管置入到刚过子宫颈内口水平，低压 缓慢注入3 m l 生理盐水，立即回收。G r i f f i t h J o n e s 采用的是一中 空塑料套管，在超声监控下引入子宫腔下部，再用
7、一细管插入其中， 并伸出i c m ，滴注5 m l 生理盐水，回收并用于分析。研究取样工具表 明均为单通道抽吸冲洗，推入3 一- 5 m i 冲洗液，回收的液体约O i m l 。如注入的冲洗液较多，孕妇有不适感，也可能对胚胎产生不 良影响，又不宜反复冲洗增加感染机会。故冲洗工具有待改进，以 提高液体回收率，减少副反应。针对单通道抽吸冲洗缺点，我们研 制了新的宫腔冲洗工具双腔管，并利用双腔管循环宫腔冲洗法 取样。与单通道冲洗法相比，取样成功率分别为7 3 9 和4 4 8 p 0 0 5 有显著差异。因为子宫腔下段胎儿脱落细胞相对较多，孕期 宫颈粘液的变化使精子不易穿过宫颈管进入富腔，循环冲
8、洗及回收 的过程均在子宫腔下段进行，故减免了精液污染机会及阳性细胞的 丢失，且冲洗液回收量较多，孕妇无明显不适感。因此双腔管也不 失为一种良好的取样工具。 三、取材的孕龄选择 根据绒毛的发育以及需要在孕早期行产前诊断的目的，获取胎 儿脱落细胞的孕龄适宜在孕6 1 1 周。因在这一阶段，胚泡经历了 由三级绒毛覆盖到除胎盘部位外均变为平滑绒毛膜的过程，绒毛尚 讨论在职人嫩申请硕士研究生诧_ j = 未竞全逡，纯，聪藩缨魏较多。魏努，孕8 黉蓠富聚淹譬紧，不易臻孬， 蕊u 髑螽取榉，一旦产藏诊断结果异常拟终止姆娠，人工流产最健 簿爨已过，建壤热怼母亲懿损臻，嗣霹，貉囊增大潺充满富装，不 翁再行鼗脏操
9、作。因此，经子黧下段取榉行产蔚诊断，成选择在缄 罨来意全退纯之蔫，漩藩缨您较多，嚣黪遴未完全充满塞麓懿露嫒。 有报道搬出，在孕8 1 0 周行寓腔下段冲洗，此时胚外体腔仍把萍 骥寒绒乏簇隔开，寒叁绒毛膜瓣绒毛褒蒸末藕形成缍爨滋葬层瓷， 除胎盘部位外，绒毛直接与包蜕膜接触，冲洗取样时，藏好能冲到 题蠖骥下兹缄遗及黢落戮富耱感戆漤棼缨麓，基对羟艟艇影皎较 小。也村报道认为在孕7 1 0 阈取材较合适。为确证在予宫下段取 谨萼亍产藏诊陵豹最谴辩楗，蓑稍将台薅滋养缀蹙靛获取攀及获取缨 胞的平均个数与孕龄媚眈较。研究表明，滋养细胞的获取率及细胞 数较多靛孕蘩程4 l 7 密天( s 掩溪) ，是产裁诊蘸
10、覆磷渖洗法经 生殖道取样的良好时机。 疆、获凝蘩麓种类及鍪定运题 在子宫腔下部获墩的标本，宙有母体细胞及少量胎，k 细胞。蹲 体缨魏烹要是蜕貘篷织靛缀貉，菠蕊分鞠当复杂。据箕泉源哥将蜒 膜组织铀艟大致分三粪：( 1 ) 子寓内骥滋性缅胞。包括蜕膜基质缁 懑，上皮绩德帮艇管内寂缡骢；( 2 ) 嚣懿滚注自缨艟。包撼丈颗粒港 巴细聪，蜕膜匿爝缀耱，彳细穗黻及少许B 缅骢；( 3 ) 受镪至蜕貘麓 绒毛辨嬲照滋莽细胞。蔟孛蜕髅基覆缨魏是蠖膜浆主要艘分，约占 全部蜣貘绥穗数豹7 戮。骆j L 缨缒主要怒绒毛滋养层绥魏。滋莽络 越有三大亚类；筑骢滋葬缨照，合俸滋游缨鼹，绒毛夕 钓瞧滋葬续 麓8 。台俸滋
11、葬缀憨形态学特点龌显，瑟缩蕤滋葬纲怒麓虢骥鏊矮 绷胞十分类似，不易鉴别。因j 毙，实验以合转滋嚣细胞为记数缨照。 蠹予维憝漤葵缍照与蜕貘基袋缨稳不荔区龛蠢显疆藩翡舍嚣滋葬 细胞姐发生变憋超不易确讥鼓常用兔嫒组化方法对矮行形态学研究。免 疫经纯方法或黪茹缨庭分塞恭都要求鸯赞对滋葬镪魅艴耱器佳藏拣最 然研究鞍多，但斟前尚未确定一手申勰与各 自滋养细胞发生反皮完全特异 浚按彝。C o v o n e 等( 1 褥4 ) 渐摄遴耀H 3 1 5 擎竞隆摅凑骚孕螺乡 震煎分 讨论在职人员申请硕l 二研究生论j 离滋养细胞，但混有相当数量的母体细胞，特异性不强M o t o iS a s a g a w
12、a 。“ 研究指出单抗T r o m a l 及c 鹏2 同合体滋养细胞及细胞滋养细胞反应 不同蜕膜基质细胞反应，但同蜕膜中的腺上皮细胞及许多单核细胞反应。 M u l l e r ( 1 9 9 0 ) ”经过6 0 0 0 多次实验，筛选出5 种抗滋养细胞的单抗， F D 0 1 6 1 G 、F D 0 6 6 Q 、F D 0 3 3 8 P 、F D 0 9 3 P 、F D 0 7 8 P ，用其中的两种F D 0 6 6 Q ， F D 0 3 3 8 与免疫磁珠结合，成功的分离了滋养细胞。B r u c h 等人( 1 9 9 1 ) 应用单抗G B l 7 、G B 2 1
13、、G B 2 5 ，对合体滋养细胞进行分离。C a t h e r i n e 等 人( 1 9 9 3 ) 对单抗F D 0 4 朗、F D 0 1 6 1 G ，及F D o l O i X 研究表明，F 1 1 3 4 6 B 对人 合体滋养细胞有明显特异性，尤其是对孕前三个月的胎盘，与人类其它组 织未发现交叉反应：F D 0 1 6 1 G 同合体滋养细胞、非绒毛细胞滋养细胞及 合成类固醇的组织如肾上腺反j 立，同其它 类组织不反应：F D O I O I X 同人 类合体滋养细胞强烈反应，对其它组织不反应。D e a nD a y a , ( 1 9 9 5 ) 研究 认为，C y
14、t o k e r a t i n ( A E l A E 3 ) 对各种类型的滋养细胞是很好的标识物，同 蜕膜基质细胞不反应，但同腺上皮细胞反应。G r i f f i t h - J o n e s ( 1 9 9 2 ) 和 M i l l e r ( 1 9 9 8 ) 在免疫组化研究中，应用抗体N D O G l ，F T l 4 1 1 与合体滋养 细胞发生特异反应。有许多文献也详述了抗体h C 6 , h p l 及s p l ，剖门同合 体滋养细胞及中间型滋养细胞反应，但与细胞滋养细胞不反应，h C G 较 h p l 更不敏感。单克隆抗体3 4 0 可辨认在合体滋养细胞和细胞
15、滋养细胞 上的表面抗原，D u r r a n t 把它用于与免疫磁珠结合分离滋养细胞“1 。抗滋 养细胞抗体的研究多处于实验室阶段，或者特异性不强，或者研究较少 尚未商品化。白求恩医科大学免疫教研室的柳宗辉教授在国内首次研制 了抗滋养细胞抗体，并通过了鉴定。揖们实验得到了他的好意提供。 通过我们免疫组化实验中多核细胞与抗滋养细胞抗体发生的强阳性 反应，进一步证实了从宫腔下段获取的多核细胞是来自于胎儿的合体滋 养细胞。从免疫组化染色得出的滋养细胞获取率同巴氏染色结果比较无 显著性差异，分析这一结果是由于合体滋养细胞的形态特殊，不易与其 它细胞相混淆：脱落的合体滋养细胞尚未发生明显变形或变性。因
16、此， 实验中获取的多核细胞的性质及获取率是确切的。 五、双腔管循环宫腔冲洗法取样的安全性 人们最关心产前诊断取样操作对母儿的安全性问题。我们在实验中 讨论 在职人员由请硕 研究生论文 双腔管的外径约4 0 m ，操作时，双腔管停留于宫颈内口上1 5 0 m ，不 深入宫腔，不会伤及眙儿；冲洗时低压进液，同时回流，避免了单通道 冲洗取样时出现的孕妇不适感和对胎儿的不良反应。并且由于宫腔内始 终处于低压状态，故可以不限制液体量。人工流产术、上节育环技术、 诊断陛刮宫术的广泛应用以及绒毛活检技术的研究，使我们对宫腔操作 技术积累了大量的经验，只要严格无菌操作，双腔管循环宫腔冲洗法应 是一种安全、损伤小的取样技术。 为了慎重起见，实验也对循环冲洗取样的安全 生做了短期观察。选 择对缘为拟行药物流产的早孕妇。结果表明，循环冲洗取样能控制取材 深度，顶端钝圆，外径小，严格遵守操作规程，不会对母儿产生损伤。 总之，经孕妇生殖道主要是经富颈在子宫腔下段取样进行产前诊断有很 大的发展前
