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1、植物细胞工程n植物细胞工程:是一门以植物组织和细胞的离体操作为基础的实验性学科。它是以植物组织细胞为基本单位,在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作,使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变,从而改良品种或创造新物种,或加速繁殖植物个体,或获得有用物质的过程统称为植物细胞工程。植物细胞工程是在植物组织培养的基础上发展起来的,因此,植物细胞工程亦是广义概念上的植物组织培养。 n植物细胞工程中心内容就是植物细胞、组织的培养n植物细胞工程从技术上说它是一种从单细胞到植株的无性繁殖技术n从遗传的角度来讲它具有遗传的保守性和变异性。其保守性可以进行植物的快速繁殖,建立植物物种资源库,利用其变异性我
2、们可以进行体细胞诱变、体细胞杂交以及基因工程等植物组织培养的发展简史n 探索阶段(19世纪初30年代中)德国植物生理学家HaHerlandt首次进行了植物细胞培养实验 奠基阶段(3050年代) 1934年,White培养番茄离体根尖成功 1939年,Gautheret连续培养胡萝卜根形成层首次成功n 迅速发展阶段(60年代后)n原生质体,花药,快繁技术迅速发展1958年Steward和Reinert用胡萝卜根的愈伤组织诱导成了体细胞胚,并进而获得了完整植株。 n科学研究表明,处于离体状态的植物活细胞,在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下,就可能表现出全能性,发育成完整的植株。人工条件下
3、实现的这一过程,就是植物组织培养。一、细胞的全能性1、定义: 生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特性。 2、原理:生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质,都有发育成为完整个体所必需的全部基因,从理论上讲,生物体的每一个活细胞都应该具有全能性3、差异: 受精卵的全能性最高 (2) 受精卵分化后的细胞中,体细胞的 全能性比生殖细胞的低。 4、潜在全能性的原因: 基因表达的选择性 二、植物组织培养1、概念:科学研究表明,处于离体状态的植物活细胞,在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下,就可能表现出全能性,发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程,就是植物组织培养2、
4、植物组织培养过程离体的植物器官、组织或细胞-愈伤组织-根芽-植物体脱分化 由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程,称为植物细胞的脱分化。再分化脱分化产生的愈伤组织继续进行培养又可以重新分化成根或芽等器官,这一过程称为植物细胞的再分化。植物组织培养一般分为以下几种 1、胚胎培养:指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养。 2、器官培养:指以植物的根、茎、叶、花、果等器官为外植体的离体无菌培养,如根的根尖和切段,茎的茎尖、茎节和切段,叶的叶原基、叶片、叶柄、叶鞘和子叶,花器的花瓣、雄蕊(花药、花丝)、胚珠、子房、果实等的离体无菌培养3、组织培养:分离出植物各部位的组织
5、(如分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮、皮层、胚乳组织、薄壁组织、髓部等),或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。这是狭义的植物组织培养。 4、细胞培养:指以单个游离细胞(如用果酸酶从组织中分离的体细胞,或花粉细胞,卵细胞)为接种体的离体无菌培养。 5、原生质体培养:指以除去细胞壁的原生质体为外植体的离体无菌培养三、植物再生途径到底通过哪种途径再生,与试验材料和培养基尤其添加的激素有关四、愈伤组织的种类1、胚性愈伤组织(Embryonenic callus):表面光滑,组织结构紧凑,细胞小、再生能力强 。 胚性愈伤组织容易形成体胚,所以称为胚性愈伤组织 2、非胚性愈伤组织:表面粗糙、组
6、织结构疏松、细胞大 。 一般,非胚性愈伤组织诱导率较高,可达到100,即100的外植体可以形成愈伤组织;而胚性愈伤组织诱导率相对较低。 1、胚性愈伤组织的诱导n花药,幼胚、茎尖培养容易形成胚性愈伤组织或直接形成胚状体,但茎、叶片、叶柄等外植体在适宜的培养基上也能形成胚性愈伤组织或胚状体。 胚性愈伤组织诱导培养基一般只加生长素,并以2,4D效果最好。但植物不同,或组织不同,添加的浓度差别很大。如小麦幼胚培养适宜 2,4D浓度为2mg/L,甘薯茎尖培养为0。22。0mg/L,因品种不同而2、体细胞胚的形成n胚性愈伤组织形成后,有的在胚性愈伤组织诱导培养基上能直接形成体细胞胚,如花生及其野生种、小麦
7、、甘薯的部分品种等不需要转培养基,可直接形成体细胞胚。但还有些情况,必须将胚性愈伤组织转移到体细胞胚诱导培养基上才能形成体胚。据报道,脱落酸(ABA)有利于体胚形成,如甘薯,添加0。5mg/L。 胚状体发育到一定阶段,容易与周围的细胞发生隔离,很容易从愈伤组织剥离下来。这是因为胚状体周围有一层“边缘细胞层”,后来次层细胞退化解体,使胚状体与周围组织间形成间隙。3、体细胞胚发芽及植株再生将形成体细胞胚的愈伤组织带体胚转移到不含激素的培养基上后,体胚发育成成熟胚,并发芽,再生植株。4、影响胚胎发生的因素1)、生长调节物质(激素) 对胚性愈伤组织的形成及体细胞胚胎发生影响最大的是激素。 胚性愈伤组织
8、诱导,培养基中加入生长素类有效,尤其2,4D。但不同植物,或同一植物不同品种,对2,4D浓度的要求不同。一般添加0.52.0mg/L,但也有的植物浓度需要很高,如花生需要在10mg/L以上。体胚的诱导,有的情况下可以在胚性愈伤组织上直接诱导出体胚,但也有的情况下,必须将胚性愈伤组织转移到体胚诱导培养基上才能形成体胚。不同的植物,或同一植物不同品种,体胚诱导培养基不同。有的在不加激素的培养基上有效;有的需要加低浓度的生长素( 0.010.1 mg/L ),有的加激动素(KT)或脱落酸(ABA2)、氮源n培养基中NH+4有利于体胚发生。如加入0。1M NH+4Cl可以促进胚状体的发育。 氨基酸、酰
9、胺等有机酸也能促进体胚的发生。柳乳、酵母提取液、水解酪蛋白等含有多种氨基酸,培养基中加入某一种有利于体胚发生。 n3)、植物基因型的影响 : 不同植物,或同一植物不同品种(不同基因型)间胚性愈伤组织形成及体胚发生能力差别很大,并且所需挤塑剂浓度也不同4)、植物的来源和年龄n外植体不同体胚发生能力也不同。一般,生长点、幼胚、花药、花粉等容易形成胚性愈伤组织和体胚。 n5)、其他因素 培养温度、光照时间和强度等也会影响体胚发生 一般,胚性愈伤组织诱导需要在黑暗下进行,待转到体胚诱导培养上后,可在光照下培养5、以甘薯为例n甘薯育苗取茎顶5厘米, 去掉叶片 -冲洗- 超净工作台内表面杀菌 显微镜下取茎
10、 添加0。2mg/LNAA,2mg/L6BA,3蔗糖,0。8琼脂的MS培养基(pH5。8)上培养- 1个月左右长出不定芽 -再生芽长至5cm以上,切下,并移植于MS基本培养基上 -长大后,12个节间一段移植于新的MS基本培养基上,进行扩繁 -炼苗4天左右,移栽于趾石:草炭土1:1的基质中 -成活后,移栽塑料棚,再扩繁 -田间移栽。 六、愈伤组织诱导及植株再生n(一)、愈伤组织形成的过程外植体中已分化的活细胞,在外源激素的诱导下通过脱分化后形成愈伤组织,这一过程被大致划分为三个时期(诱导期、分裂期和形成期)。1、诱导期:即细胞分裂的准备期。接种的外植体材料的细胞通常都是成熟细胞,处于静止状态,细
11、胞大小没有多大变化,外观无明显特征,但细胞内物质代谢旺盛,王凯基等(1981)在研究离体培养的油橄榄茎段时发现,细胞内合成代谢活跃,RNA含量迅速增加,细胞核体积明显增大。 诱导期的长短,因植物种类和外植体的生理状况和外部因素而异,如胡萝卜的诱导期要好几天,新鲜的菊芋块茎则只要22h,但菊芋块茎经过5个月的贮藏后,诱导期则须延长到40h以上。特点:1.细胞的数目迅速增加。如胡萝卜培养7天后,细胞数可增加10倍。 2.每个细胞平均鲜重下降。这是由于细胞鲜重的增加不如细胞数目的增加快的缘故。 3.细胞体积小,内无液泡,如同根尖和茎尖的分生组织细胞特性。 4细胞的核和核仁增大到最大。 5.细胞中RN
12、A含量减少,而DNA含量保持不变。 6. 随着细胞不断分裂和组织生长,细胞的总干重、蛋白质和 核酸含量大大增加,新细胞壁的合成极快总之,分裂期的愈伤组织的共同特征是:细胞分裂快,结构疏松,缺少有组织的结构,维持其不分化的状态3、形成期n从愈伤组织到器官发生 形成期是指外植体经过诱导期和分裂期后形成了无序结构的愈伤组织的时期。进入形成期后,细胞的平均大小相对稳定,不再减少,细胞分裂由原来局限在组织外缘的平周分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂,结果形成瘤状或片状的拟分生组织,称做分生组织结节。分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心,或者进一步分化为维管组织结节由分生组织结节外围的细胞作平周分裂成
13、为形成层状细胞,并形成了部分维管组织如管胞、纤维细胞等,但不形成维管系统。由于此期细胞分裂已基本停止,细胞内发生生理代谢等的变化而开始形成一些不同形态和功能的细胞,因此有人又将此期称为分化期。 (二)愈伤组织的继代培养:脱分化细胞不断进行分裂,从而形成了愈伤组织,愈伤组织在培养基上生长一段时间以后,由于营养物质枯竭,水分散失,以及代谢产物的积累,必须转移到新鲜培养基上培养。这个过程叫做继代。通过继代培养,可使愈伤组织无限期地保持在不分的增殖状态。然而,如果让愈伤组织留在原培养基上继续培养而不继代,它们则不可避免地发生分化,产生新的结构。 (三) 愈伤组织的生长 一般来说,愈伤组织的增殖生长只发
14、生在不与琼脂接触的表面,而与琼脂接触的一面极少细胞增殖,只是细胞分化形成紧密的组织块。它是愈伤组织表面或近表面瘤状物生长的结果。愈伤组织之间的质地有显著不同,有的很松脆,有的很坚实,且这两类愈伤组织可互相转变。其方法是:加入高浓度的生长物质,可使坚实的愈伤组织变为松脆。松脆愈伤组织都有大量的分生组织中心,进行活跃的细胞分裂;而不脆的愈伤组织很少分化,大都是高度液泡化的细胞。脆的愈伤组织是进行悬浮培养最适合的材料,稍经机械振荡,即可使组织分散成单细胞或少数几个细胞组成的小细胞团。在培养中细胞产生迅速增殖,而坚实的愈伤组织中的细胞间被果胶质紧紧地粘着,因而往往不能形成良好的悬浮系统愈伤组织的质地不
15、同是由其内部结构上的差异所引起的。坚实致密的愈伤组织内无大的细胞间隙,而由管状细胞组成维管组织;松脆愈伤组织内有大量的细胞间隙,细胞排列毫无次序。 生长旺盛的愈伤组织一般呈奶黄色或白色,有光泽,也有淡绿色或绿色的;老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。 外植体的脱分化因植物种类和器官及其生理状况而有很大差别,如烟草、胡萝卜等脱分化较易,而禾谷类的脱分化较难;花器脱分化较易,而茎叶较难;幼嫩组织脱分化较易,而成熟的老组织较难。一个多细胞外植体通常包含着各种不同类型的细胞,因此,由它所形成的愈伤组织也是异质性的,其中不同的组分细胞具有不同的形成完整植株或器官的能力,即不同的再分化能力。(四) 愈伤组织的形态发生方式 愈伤组织分生细胞团可进行再分化,即进行形态建成,可再产生完整的植株。形态建成:外植体在适宜的培养条件下经脱分化、分化或直接发育成各种形态完整的植物体的过程。在愈伤组织培养物中,细胞分裂常以无规则方式发生,并产生无明显形态或极性的无序结构组织块,这时虽然在愈伤组织中发生了细胞分化,形成维管化组织和瘤状结构,但并无器官发生。只有满足某些条件,才可从愈伤组织发生