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1、第九节 高密度发酵,高密度发酵：指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L。 高密度发酵可以提高发酵罐内的菌体密度，提高产物的细胞水平量，相应的减少了生物反应器的体积，提高单位体积设备生产能力，降低生物量的分离费用，缩短生产周期，从而达到降低生产成本，提高生产效率。,一、影响高密度发酵的因素,培养基；溶氧； pH；温度；代谢副产物 1 培养基:高密度发酵对基质中营养源的种类和含量比要求较高，如碳源和氮源的比例偏小，会导致菌体生长旺盛，造成菌体提前衰老自溶；比例偏大，则菌体繁殖数量少，细胞代谢不平衡，不利于产物积累。,葡萄糖是高密度发酵中常用的碳源，但
2、浓度过高，会产生乙酸，因此要保证较低的葡萄糖浓度。 氮源、微量元素和无机盐对细菌的生长繁殖和外源蛋白的表达也有很大影响。,2 溶氧浓度 随着发酵时间的延长，菌体密度迅速增加，溶氧浓度随之下降，细胞的生长减慢。特别是高密度发酵的后期，由于菌体密度的扩增，耗氧量极大，发酵罐各项物理参数均不能满足对氧的供给，导致菌体生长极为缓慢，外源蛋白的表达量也较差。,在发酵过程中保证适宜的溶氧浓度，必须确定发酵罐的通气量和搅拌速度。 在一定范围内，通气量越大，溶氧浓度越高。 若气流速度过大，会使发酵液产生大量泡沫，使罐的有效利用率降低。,3 pH 大肠杆菌利用葡萄糖产酸产气，特别是大量的乙酸和二氧化碳，使pH降
3、低，必须调节pH在适宜的范围。,4 温度 培养温度在适宜的范围，对于温控诱导表达的基因工程菌来说，诱导时机和持续时间对于重组蛋白的产量由很大影响。,5 代谢副产物 乙酸 二氧化碳 葡萄糖的浓度超过某一阈值，会产生乙酸，或者比生长速率过高，供氧不足，也会产生乙酸。为降低培养基中代谢副产物的积累，可采用流加补料的措施，或保持适当的比生长速率，或在培养基中添加某些氨基酸。,二 、实现高密度发酵的方法,1 发酵条件的改进 培养基的选择：采用甘油作为碳源 建立流加式培养：营养过高抑制细胞生长，高密度发酵是以低于抑制阈的浓度开始的，营养物是在需维持高生长速率是才添加的。 提高供氧能力：通入空气与氧混合气体
4、；增加压力；发酵液中添加过氧化氢。,2 构建出乙酸化能力低的工程化宿主菌 通过发酵条件的改进可以减少乙酸的产生，但是难以做到精细的调控，通过切断细胞代谢网络上产生乙酸的生物合成途径，构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌，是从根本上解决问题的途径之一。,阻断乙酸产生的主要途径：基因敲除或突变产生乙酸代谢突变菌株。 对碳代谢流进行分流：丙酮酸代谢有选择的向乙醇的方向进行。,限制进入糖酵解途径的碳代谢流：大肠杆菌对葡萄糖的摄取是在磷酸转移酶系统的作用下通过基团转位的方式进行的，通过基因敲除法限制葡萄糖的摄取速率。 引入血红蛋白基因：提高大肠杆菌在贫氧条件下对氧的利用率。,3 构建蛋白水解酶活力低的工程化
5、宿主菌 对于以可溶性或分泌形式表达的目标蛋白而言，随着发酵后期各种蛋白水解酶的累积，目标蛋白会遭到蛋白水解酶的作用而被降解。,第八节 基因工程药物的分离纯化,基因工程药物的分离、纯化非常重要。表达的产物都是多肽或蛋白质 。它的制得具有以下特点：,表达产物在初始料中含量较低； 初始物料组成复杂，含有大量细胞及代谢产物、残留培养基等。 表达产物稳定性差，易失活变性； 表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异； 对其质量要求纯度高、无菌、无热原。,一、建立分离纯化工艺的根据,含目的产物的初始物料的特点 菌种的类型及其代谢特性。原材料培养基的来源及其质量。生产工艺及条件。 物料中杂质的种类和性质。 目的
6、产物特性。 产品质量的要求。,二、分离纯化的基本过程 由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细胞生产的，所以对产品的纯度要求也要高于传统产品。 基因工程药物的分离纯化一般不应超过4-5个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工,基因工程药物分离纯化的一般流程,发酵液,细胞分离,胞内产物,胞外产物,细胞破碎,固液分离,包含体,细胞碎片分离,变 性,复 性,浓 缩,初步分离,高度纯化,制 剂,产 品,分离纯化的技术要求： 技术条件温和能保持产物生物活性。 选择性好，能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离，达到较高的纯化倍数。,收率要高。 两个技术间能直接衔
7、接，不需要对物料加以处理。 纯化过程要快，满足高生产率的要求。,三、细胞的破碎方法,物理法：匀浆法；珠磨法和超声法 化学法：渗透冲击，增溶法 生物法：酶溶法,1、物理破碎法,匀浆法：利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀后，因高速撞击和突然减压而使细胞破裂的方法。 可以大规模应用，不适用于易造成堵塞的团状或丝状真菌。,高速磨珠法：将细胞悬浮液与研磨剂一起快速搅拌或研磨，利用玻璃珠间以及玻璃珠与细胞间的相互剪切、碰撞促进细胞壁破裂而释放出内含物。 产生大量的热，必须采取冷却措施。,超声破碎法：利用超声波来处理细胞悬浮液，在超声波作用下，液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，
8、使细胞破碎。 可处理少量样品，产生热量大，敏感物质易失活。,2、化学破碎法,渗透冲击：先将细胞置于高渗透压介质，达成平衡后，突然稀释介质，在渗透压的冲击下，使细胞壁和膜膨涨破裂。 适用于细胞壁较脆弱的，经过酶处理的细胞壁。,增溶法：利用表面活性剂等化学试剂的增溶作用，增加细胞壁和膜的通透性使细胞破碎的方法。 表面活性剂：SDS；TritonX-100 有机溶剂：乙醇；异丙醇，尿素 缺点：添加新的化学试剂，造成新的污染。,3、生物破碎法,酶溶法：利用生物酶消化溶解细胞壁和细胞膜的方法。 细胞壁溶解酶是几种酶的复合物，必须根据待处理细胞的结构和化学组成来选择适当的酶，并确定相应的使用次序。 价格高
9、，回收利用困难，仅在实验室用。,四、固液分离,1、离心沉淀 2、膜过滤：微滤；超滤；反渗透 3、双水相萃取：两种水溶性高聚物或一种高聚物与无机盐在水溶液中混合而成。两相均含较多的水。,五、重组蛋白质的分离纯化,目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。 蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。,产 物 特 性 作 用 等电点 决定离子交换种类及条件 相对分子量 选择不同孔径的介质 疏水性 与疏水、反相介质结合的程度 生物特异性 决定亲和配基 溶解性 决定分离体系及蛋白浓度 稳定性 决定工艺采用温度及流程时间,产物的特性在分离纯化中的作用,分离纯化的方法依赖色谱分离方法,1、
10、离子交换层析 离子交换层析的基本原理是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。 它具有分辨率高容量大操作容易，该法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要方法。,2、疏水层析,疏水层析是利用蛋白质表面的疏水区域与固定相上疏水性基团相互作用力的差异，对蛋白质组分进行分离的层析方法。 蛋白质与疏水性介质的作用力小，分离过程中活性不易丧失。,3、亲和层析,亲和层析是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。,配基：在亲和层析中起可逆性结合的特异性物质。 载体：与配基结合的支撑物。 亲和层析大体可分三步： 配基固定
11、化 吸附目的物 样品解吸,4、凝胶过滤,凝胶过滤是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。,主要应用两个方面： 脱盐和更换缓冲液 蛋白质分子的分级分离。 在产品的形成阶段前用于除去产物的多聚体及降解产物。,基因工程药物生产中常用的分离纯化方法,方 法 目 的 离心/过滤 去除细胞、细胞碎片、颗粒性杂质 阴离子交换层析 去除杂质蛋白、脂质、DNA、病毒 40nm微孔滤膜过滤 进一步去除病毒 阳离子交换层析 去除牛血清蛋白或转铁蛋白等 超 滤 去除沉淀物及病毒 疏水层析 去除残余的杂蛋白 凝胶过滤 与多聚体分离 0.22m微孔滤膜过滤 除 菌,六、非蛋白质杂质的去除,DNA、热原质和病毒的纯化方法： 1、 DNA的去除：DNA在pH4.0以上呈阴离子，可用阴离子交换剂吸附除去,目的蛋白的pI应该在6.0以上。亲和层析和疏水层析也有效。,2、热原质的去除：热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖），去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法。 3、病毒的去除：层析或过滤可将病毒去除。,
