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1、五、神经生物学常用的研究方法,（一）形态学方法 （二）生理药理学方法 （三）生物化学方法 （四）电生理学方法 （五） 分子生物学方法 （六）脑成像（Brain imaging）技术,（一）形态学方法,1、束路追踪法 2、免疫组织化学法 3、原位杂交法 4、受体定位法,束路追踪法,研究神经元之间的纤维联系是神经科学研究领域的一个基本问题，其研究方法主要有三： （1）利用神经元轴浆运输现象的追踪法，是目前应用最广者； （2）利用神经元胞体受损或轴突离断后远侧轴突的变性，或轴突切断后胞体的反应特性的变性追踪法； （3）利用某些荧光染料在神经细胞质膜扩散的神经元质膜荧光追踪法。,（1）轴浆运输追踪法
2、轴浆运输：神经元有长短不等的轴突，由于轴突内缺乏参与蛋白质合成的核糖体，所以需要从细胞体不断地将各种成分运输至轴突及其分支以维持其代谢；在神经末梢释放的神经肽及合成经典递质的酶也需在胞体合成；从末梢也有影响细胞代谢的物质如神经营养因子等逆向传送至胞体。不同物质的运输速度不同。 顺行运输：从胞体向轴突及其终末的运输。 逆行运输：从轴突及其终末向胞体的运输。,常用方法： a 辣根过氧化物酶追踪法 1971年，Kristenson和Olsson首先报道辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）可被神经末梢摄取，经轴浆逆行运输至神经元胞体，然后用组织化学方法即可显示出神经元
3、的轮廓，从而创建了HRP追踪神经元示踪技术，即HRP法。 HRP即可作逆行追踪剂使用，也可作顺行追踪剂使用。 基本步骤： 将HRP注射至实验动物中枢核团或周围器官、神经的一定部位；存活一定时间后灌注、固定动物，取材作冰冻切片；然后用双氧水（H2O2）及呈色剂四甲基联苯胺（TMD）或二氨基联苯胺（DAB）显示HRP反应产物。,将HRP注射于周围神经感觉末梢 或神经干逆向标记背根神经节细 胞后，HRP还可进一步沿背根节 细胞的中枢突顺向标记其在脊髓 的中枢终止部位，称作跨节标记。,HRP：1.游离HRP： 通过非特异性整体胞饮的方式被摄入 2.结合HRP：通过与细胞膜的特异性受体结合的介导进入神经
4、元 麦芽凝集素（WGA）-HRP 霍乱毒素（CT）-HRP 优点：灵敏度高，用量较少， HRP在胞内降解时间明显延长， 能清晰地显示包括细微分支在内的整个神经元的全貌。 注意：因为HRP到达预定部位的时间取决于运输速度和距离，运输速度因动物及纤维种类而异。同时HRP被运至胞体后即被送入溶酶体内水解。因此在聚集和降解两个相反的过程中求得最佳存活期必须具体测试。 呈色剂： 1.二氨基联苯胺(DAB): DAB作为供氢体，HRP在H2O2存在的情况下，能使DAB发生氧化，生成不溶性棕褐色反应产物沉淀，定位在抗原所在处。 2.二盐酸联苯胺(BDHC) 3.邻-联茴香胺(OD) 4.四甲基联苯胺(TMB
5、) 用途： 研究脏器的神经支配、中枢内核团间的联系等。还可与免疫组织化学、电镜技术等结合。,HRP labelling neurons in oculomotor nucleus of cat,10,40,HRP labelling neurons in dLGN,40,b 荧光素追踪法-主要作逆向追踪 1977年，荷兰著名神经解剖学家Kuypers及其同事首先发现部分荧光化合物可被神经纤维的末梢摄取，并通过轴浆流逆行运输到各自的神经元胞体，切片后在荧光显微镜下可直接观察到这些胞体的定位，从而建立了研究神经纤维联系的荧光素逆行追踪法。 原 理： 将荧光物质注射至神经元的轴突分布区, 经分支的末
6、梢吸收后，循轴突逆行输送至胞体。在荧光显微镜 下可看到胞体内呈现荧光标记物。,荧光素追踪剂是一种暴露在一定激发波长光照下，以一定发射波长发出一定颜色荧光的化合物。每一种荧光素都有各自的激发波长和发射波长，不同的发射波长决定了这些荧光素发出的荧光颜色各异。 不同荧光素在神经元内的标记特征不同： 绝大多数标记细胞质，如荧光金（Furogold，灵敏度高，能较好显示树突分支，只标记胞浆；在胞体内分解慢，甚至在注射后存活2个月标记强度仍无明显变化；比较耐紫外线的照射，褪色比较缓慢；可以经受许多组织学染色处理，因而可以和HRP、免疫组织化学等结合使用），fast bule（固蓝）等。 只有少数仅标记细胞
7、核，如nuclear yellow（核黄 ）, diamidino yellow（双脒基黄）等。,Fast blue labelling neurons,DRG,Spinal cord,20,20,Fast Blue Ladelling Ganglion Cells of Retina,20,优点：可靠性，灵敏性， 利用其不同颜色可同时追踪和显示多重神经联系。因此可选择一种或两种以上的荧光素分别对神经元进行单标、双标或多重标记。 双重标记和多重标记可用来研究神经元轴突的分支投射。若在脑内不同核团或区域分别注射两种（或三种）不同荧光，在同一神经元胞体内能观察到两种（或三种）不同颜色的荧光，即说明
8、该神经元的轴突分支分别投射到注射这些荧光剂的两个（或三个）脑内不同核团或区域。 需要注意的是各种荧光素逆行运输的速度不同，所以动物存活时间也有差异。双重标记是，有时需要做两次手术先注射运输慢的荧光素，过一定的时间后，再注射运输较快的荧光素。 缺 点：激发光照射下很快褪灭，因此允许观察的时间较短，保存时间也有限。 应 用：研究神经元的轴突分支至不同部位的投射。可与免疫组织化学结合，研究投射神经元的化学性质。,（2）变性束路追踪法 利用神经元的轴突被损伤之后，在损伤的近侧端和远侧端分别发生逆行和顺行溃变；神经元胞体受损后，其发出的轴突从胞体向终末方向的远侧端发生顺行溃变，来研究纤维的联系。,损伤手
9、段： 物理性方法 锐器的切割、电凝、电离破坏、超声破坏等 特点：无选择性，除了损伤神经元和发出的纤维以外，也能破坏通过此损伤部位的纤维，导致非特异性标记。 化学性破坏 单胺类神经毒剂：6-羟多巴胺（可选择性被儿茶酚胺类神经元摄入，经过自氧化形成若干具有细胞毒性的产物。由于整个神经元的细胞膜均可摄入6-羟多巴胺，故儿茶酚胺类神经元的任何部位都可被6-羟多巴胺破坏。不易通过血脑屏障，因此如欲造成中枢性破坏，需做脑室或脑内注射）、6-羟多巴、5,6-双羟色胺和5,7-双羟色胺（选择性破坏5-羟色胺能神经元） 胆碱类神经毒剂：乙基胆碱氮芥丙啶正离子 兴奋性氨基酸：海人酸和鹅高蕈氨酸（能够非选择性损伤神
10、经元的胞体，而不损伤轴突，故无过路纤维受损问题）,研究方法： 20世纪从40年代，镀银染色法，根据银染溃变纤维的形态变化来判断、追踪溃变纤维的方法。 20世纪从50年代，Nauta法，一种改进的溃变镀银法，能抑制正常纤维的染色而仅染出溃变纤维。 20世纪70年代，变性束路追踪法逐渐被轴浆运输追踪法所代替。 可与逆行标记法、顺行标记法、免疫组织化学、原位杂交等技术结合运用。,（3）神经元质膜荧光染色法,这类染料是利用它们能溶于细胞膜脂层内并在膜内扩散的特点。可用在活体或固定的标本上追踪纤维联系。 这类染料中DiI、DiA和DiO最常用。 主要优点是可用于固定标本，一些难以在活体注射的小核团在固定
11、标本上常比较容易做到。 缺点是其在膜内扩散的速度很慢，而且有效距离比较短，因此最适用于胚胎或小动物。,免疫组织（细胞）化学法,20世纪70年代，免疫组织化学技术被引入脑研究领域，它以特异性强、灵敏度高的特点，使神经元内所含的神经活性物质、受体和转运体可视化，给形态学研究开辟了新的途径。,基本原理 利用免疫学中抗原与抗体特异性结合的特点以及组织化学的原理，在组织或细胞标本中加入特定的标记抗体，然后对标记物进行显示，从而对组织或细胞内的抗原物质进行定性、定位或定量研究。,免疫酶技术显示Caspase-3,免疫荧光技术显示MOR,因为抗原与抗体的结合是高度特异的，所以免疫组织化学方法具有高度的特异性
12、、灵敏性和精确性。 免疫组织化学的抗原通常是肽或蛋白，有数量不等的抗原决定簇。抗原决定簇由暴露于抗原表面、在空间上相邻的3-8个氨基酸组成。一个抗原上可以有多个抗原决定簇。故由此而产生的抗血清中可能含有针对不同决定簇的多克隆抗体。用杂交瘤技术可以制成针对单个决定簇的单克隆抗体。 抗体仅识别特定的抗原决定簇，而不识别抗原本身，因此不同物质只要有相同的抗原决定簇，均可被同一抗体识别，所以在免疫组织化学法中应注意抗体的特异性及交叉反应。,抗体（antibody, Ab） 机体免疫细胞被抗原激活后，由分化成熟的终末B 细胞浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。是介导体液免
13、疫的重要效应分子。,典型的免疫球蛋白分子呈Y字型，由两条相同的重链（heavy chain, H）和两条相同的轻链（light chain, L）借二硫键连接而成。 在氨基端，重链的1/4和轻链的1/2氨基酸序列变化很大，为可变区（variable region, V）；其他部分氨基酸序列相对恒定，为恒定区（constant region, C）。,Fab即抗原结合片段（fragment antigen binding），由一条完整的轻链和部分重链（VH和CH1）组成。该片段具有单价抗体活性，能与一个相应的抗原决定族特异性结合。 Fc即可结晶片段（fragment crystalline），F
14、c段含有两条重链C端的一半，包含CH2和CH3两个功能区，它无抗体活性。Ig在异种间免疫所具有的抗原性主要存在于Fc段，同时Fc段还具有活化补体、亲细胞、通过胎盘和介导与细菌蛋白结合等生物学活性。,用木瓜蛋白酶水解IgG分子，可将其裂解为两个完全相同的Fab和一个Fc片段。,多克隆抗体 （polyclonal antibody, PcAb） 大多数天然抗原物质(如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等)往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体产生一种特异性抗体。多克隆抗体是多个抗原决定簇刺激机体后，由多个免疫淋巴细胞分泌的多种抗体的混合物。 PcAb 特异性差，易出现交叉反应。,
15、由单一克隆B细胞杂交骨髓瘤细胞产生的，只识别一种抗原表位的具有高度特异性的抗体。 优点：结构均一、纯度高、特异性强、效价高、易大量制备。,制备单一表位特异性抗体的理想方法是获得针对单一表位的浆细胞克隆，使其在体外扩增并分泌抗体。但浆细胞在体外的寿命较短，也难以培养。于是，将可产生特异性抗体但短寿的浆细胞与无抗原特异性但长寿的恶性浆细胞瘤细胞融合，建立了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞和单克隆抗体技术。,单克隆抗体 （monoclonal antibody, McAb）,组织（细胞）化学是介于细胞学与化学之间的一门科学。细胞化学的目的是使用细胞学和化学的方法使细胞（组织）内的某些化学成分发生反应，在
16、局部形成有色反应物，藉此对各种活性物质在显微镜水平进行定性、定位和定量分析。 酶组织化学：利用酶对底物的催化作用，使底物发生颜色变化，其次对该酶进行定位、定量分析。,在应用组织化学技术显示组织和细胞内化学物质及定位和定量以及代谢状态时，需要满足以下要求：,保持组织和细胞形态结构的良好状态，以便反应产物的定位精确。如果形态结构破坏而失真，则定位困难。 具备一定的特异性，以便获取正确的实验结果。 具备一定的灵敏性，以便含量极微的物质也能被显示出来。 生成的反应产物必须是有色沉淀，颗粒微细不溶，定位于原位。反应物沉淀的颜色深度与相应物质含量或酶的活性具有一定的量效关系。 反应产物具有稳定性，以便于重复观察 要有重复性。 选择的试剂必须是分析纯，对被检测物质或酶应无任何影响；实验所用器皿必须清洁无污染杂质，使用的蒸馏水应为双蒸水。 为了保证实验的可靠性、科学性，防止假阳性的发生，必须同时作对照实验。,免疫组织化学的技术分类 根据AgAb结合方式分成： 直接法 间接法 多层法 根据染色方式分成： 贴片染色 漂浮染色,按标记物的性质分成： 免疫
