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1、医疗器械无菌实验,主讲人：王文庆 山东省医疗器械产品质量检验中心 2007年6月,概 述 实验器材 实验准备 实验方法 抑菌验证 总 结,概 述,无菌医疗器械灭菌控制中的微生物检验包括医疗器械灭菌过程确认中的微生物检验，常规生产过程控制中的微生物检验，以及产品放行中的微生物检验 。 本文以GB/T 14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法 第二部分：生物试验方法中“3.无菌实验”部分，以及中华人民共和国药典 2005年版二部附录XI H“无菌检查法”为依据，对医疗器械产品放行中的无菌实验进行总结概述。,“无菌”的概念： 围绕无菌有两个英文单词，sterility和steril
2、e。前者定义为无存活微生物的程度，用于灭菌要求；后者定义为无存活微生物，用于产品名称和包装标识。在我国的诸多标准中，都将这两个单词混称为“无菌”。 对于一个给定的灭菌过程，无论灭菌的程度如何，微生物总是难免以一个有限概率存活下来 ，这种存活概率由微生物的数量、抗性以及在处理过程中微生物所处的环境来确定。 “无菌”是指微生物存活概率低于10-6； “无菌医疗器械”表示为医疗器械中，有残存微生物的医疗器械的概率小于10-6，即一百万件中不多于1件。这是医疗器械公认的无菌保证水平。,“无菌实验”的概念： 无菌实验是用于检验一次性使用无菌医疗器械是否染有活菌的一种方法。本实验系将医疗器械或其浸提液接种
3、于培养基内，以检验供试品是否有细菌和真菌污染，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染，同时也应避免在抑菌条件下进行实验操作。,实验器材,1. 仪器 超净工作台、光学显微镜、恒温培养箱、压力蒸汽灭菌器、集菌仪、比浊仪等。 2. 用具 试管、注射器、量筒、三角瓶、移液管、刻度吸管、精密pH试纸、集菌培养器、移液器、剪刀、镊子，无菌衣、裤、帽、口罩，灭菌袋或牛皮纸等。,3. 试剂 75%(V/V)乙醇、新洁尔灭(1：1000)溶液或其他适宜消毒溶液， 2mol/L盐酸溶液、2mol/L氢氧化钠溶液等； 质量浓度为9g/L的无菌氯化钠溶液、其他符合2005年版中国药典附录XI H“无菌检查法”要
4、求的稀释液和冲洗液（0.1%的蛋白胨水溶液和pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液等）。,实验准备,1. 器具灭菌 1.1 移液管、刻度吸管在管口上端内，松松地塞少许棉花，然后放于吸管筒内或牛皮纸袋内，盖严，灭菌备用。 1.2 试管、离心管、三角瓶等在管(瓶)口塞上海棉胶专用塞或纱布棉塞，塞子应塞进管口内2/3处，用牛皮纸将管口包扎紧，灭菌备用。,1.3 将注射器、针头配对，检查针头是否畅通后，将注射芯、管和针头分别放在双层纱布(或布)内，包扎严密，置带盖容器(如铝制饭盒)内，盖严，用灭菌袋或牛皮纸包扎好后，灭菌备用。 1.4 无菌衣、裤、帽、口罩等洗净晾干，配套，用灭菌袋或牛皮纸包严，湿热灭菌备用或
5、使用一次性的无菌物品。 1.5 灭菌条件为121湿热灭菌20分钟，物品切勿立即取出置冷处，以免急速冷却，使灭菌物品内蒸气冷凝造成负压，以致染菌。适于高温灭菌的器皿也可采用160干热灭菌2小时。,2. 培养基的准备 2.1 培养基的制备 硫乙醇酸盐流体培养基用于培养好氧菌、厌氧菌，改良马丁培养基用于培养真菌。 一般采用商品脱水培养基，临用时按照使用说明书进行配制，需注意培养基的PH值应符合规定，否则必须校正后，灭菌使用。 制备好的培养基应保存在2-25、避光的环境。培养基若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用。若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。,对于硫乙醇酸盐流体培养基，在供试品接种前，其
6、氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5。否则，须经100水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并应防止被污染。无菌试验培养时间结束时，氧化层高度不得超过培养基深度的1/2。 2.2 培养基的无菌性检查 临用前须对配制好的培养基进行无菌性检查，每批培养基随机取不少于 5 支（瓶），培养14天，证明无菌生长后方可使用。,2.3 培养基灵敏度检查 2.3.1 标准菌株 金黄色葡萄球菌 CMCC（B）26 003 铜绿假单胞菌 CMCC（B）10 104 枯草芽孢杆菌 CMCC（B）63 501 生孢梭菌 CMCC（B）64 941 白色念珠菌 CMCC（F）98 001 黑
7、曲霉 CMCC（F）98 003,2.3.2 菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30-35培养18-24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，23-28培养24-48小时；上述培养物用0.9无菌氯化钠溶液制成每lmL含菌数小于100cfu的菌悬液。 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23-28培养5-7天，加入3-5ml0.9无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9无菌氯化钠溶液制成每1mL含孢子数小于10
8、0cfu的孢子悬液。,2.3.3 培养基接种及结果判断 取每管装量为12mL的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天； 取每管装量为9mL的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。 逐日观察结果。空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。,3. 无菌室要求 无菌医疗器械生产企业应将微生物检测作为检测工作的重点，而微生物实验室承担着灭菌验证、环境监控、产品放行等一系列重要工作，所以说
9、无菌医疗器械生产企业拥有一个微生物实验室是十分必要的 。微生物实验室应满足无菌实验对工作环境的要求，环境洁净度10000级，无菌室操作台或超净工作台局部应符合洁净度100级单向流空气区域要求。,无菌室分缓冲间和无菌操作室。缓冲间及操作室内均设置照明灯和紫外灯，在缓冲间内应有洗手盆、毛巾、无菌衣裤放置架及挂钩等。无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流动装置，局部洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，工作台内应准备好酒精灯、打火机、镊子、剪刀、75%酒精棉等。 无菌室应在每周和每次操作前用75%(V/V)乙醇或0.1%新洁尔灭或其他适宜消毒液擦拭工作台面及可能污染的死角，开启无菌空气过滤器及紫外
10、灯1小时。在每次操作完毕，同样使用上述消毒溶液擦拭工作台面，除去室内湿气，用紫外灯杀菌应不少于半小时。,应定期检查工作台面空气菌落数，方法如下：取直径约90mm培养皿，无菌操作注入融化的营养琼脂培养基约20mL，在30-35培养48h证明无菌后，取3只培养皿在无菌室操作台或超净工作台平均位置打开上盖，暴露 30min后盖好置30-35培养48h后取出检查。3只培养皿上生长的菌落数平均应不超过l个（ 100级清洁度要求）。 无菌试验过程中应检查空气中的菌落数，方法同上。在试验开始进行时打开培养皿盖，至试验结束后盖好，按照上法培养，应符合上述要求。,无菌操作台或超净工作台洁净度应达到100级； 温
11、度为18 26 ； 相对湿度为45% 65% ； 垂直层流风速0.3m/s , 水平层流风速0.4m/s； 不同级别洁净区及洁净区之间的静压差5Pa, 洁净区及室外之间的静压差10Pa ； 粒径5m的尘粒数不得存在，0.5m的尘粒数3500个/m3； 空气流量应控制在0.751.0m/s； 细菌沉降菌数平均1cfu/皿 注：以上各指标参见YY0033-2000无菌医疗器具生产管理规范。,4.试验前准备 培养基在移入缓冲间前应先编号，并用0.1%新洁尔灭或(V/V)酒精棉等擦拭瓶(管)外壁，然后连同其他用具(包括无菌衣、帽、口罩等) 移入缓冲间；供试品移入前，外包装须进行消毒处理。 操作人员用肥
12、皂、自来水洗双手，关闭紫外灯，进入缓冲间，换拖鞋，再用75%(V/V)酒精棉等擦手，穿戴衣、帽、口罩。将所需物品剥掉牛皮纸，移入无菌操作室，准备进行实验。每次实验所用物品必须计划好，并有备用物。,实验方法,1.薄膜过滤法 2.直接接种法,1. 薄膜过滤法 1.1 供试液制备 1.1.1 供试品数量 同一批号3个-11个单位供试品。（注：不同类型医疗器械可根据具体情况参照采用。） 1.1.2 浸提介质 质量浓度为9g/L的无菌氯化钠溶液或其他符合2005年版中国药典附录XI H“无菌检查法”要求的稀释液和冲洗液。,1.1.3 供试液制备方法 根据供试品具体特性选择下列适用方法： 1) 管类器具：
13、按管内表面积每10cm2流过管内腔1mL浸提介质，流量约为10mL/min。 2) 容器类器具：容器内已装有液体的可直接抽取容器内液体为供试液；空容器按容器内表面积每10cm2加入浸提介质lmL，振摇数次。 3) 实体类器具：实体类器具按表面积每10cm2 加入浸提介质lmL，振摇数次。 制备供试液时，应使浸提介质充分洗提供试品的浸提表面。供试液制备应按无菌操作法进行，在制备后2h内使用。,1.2 接种培养基 利用集菌仪和3个一次性使用集菌培养器对供试液进行薄膜过滤。然后分别将100mL硫乙醇酸盐流体培养基加入两个滤筒内，将100mL改良马丁培养基加入第三个滤筒内。将小于100cfu的金黄色葡
14、萄球菌加入其中一个盛有硫乙醇酸盐流体培养基的滤筒中，作为阳性对照。利用9g/L的氯化钠溶液代替供试液如法操作，作为阴性对照。,1.3 培养及观察 阳性对照培养4872小时应生长良好；阴性对照不得有菌生长；细菌培养基在3035培养，真菌培养基在23-28培养，各培养14天。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。 如果在接种后、或在在培养过程中培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或划线接种于斜面培养基上，细菌培养 2 天、真菌培养 3 天。观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊或斜面是否有菌生长，或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有
15、菌。,1.4 结果判断 当阳性对照显浑浊并确有细菌生长时，可根据观察所得的结果判定。如细菌及真菌培养基均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长，判供试品符合规定。 如细菌及真菌培养基中任何1个显浑浊并证明为有菌生长，应重新取同量供试品，依法重试，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。,2. 直接接种法 2.1 供试液制备 2.1.1 供试品数量 同1.1.1 2.1.2 浸提介质 同1.1.2 2.1.3 供试液制备方法 优先采用将供试品或其有代表性的各部分直接投放入培养基内培养。如供试品不适宜直接投放，可按1.1.3方法制备。,2.2 接种培养基 取符合直接接种法培养基
16、用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基（每管装量不少于15mL）和改良马丁培养基（每管装量不少于10mL）各10管，取上述制备的供试品，在近火焰上以右手握拳，小指为主拔开培养基管的塞子，管口通过火焰， 移至火焰下侧，沿着培养基管壁接入供试品（体积不得大于培养基体积的10%），轻轻摇匀。,取硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各1管，利用9g/L的氯化钠溶液代替供试品如法操作，作为阴性对照。 取硫乙醇酸盐流体培养基1管，接入供试品，然后再接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌，作为阳性对照。 2.3 培养及观察 同1.3 2.4 结果判断 同1.4,抑菌验证,对未知或可疑的供试品，在进行无菌实验前，应对供试品进行抑菌性验证实验，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计，从而证明所采用的无菌实验方法适合于该供试品的无菌检验。 若确认供试品在该实验条件下存在抑菌作用，应采取措施消除其抑菌作用，重新进行验证。抑菌性验证实验可在无菌实验前，也可与无菌实验同时进行。 同无菌
