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1、一、分离与纯化的方法 双链DNA因固有的结构特点，是一种惰性很强的化学分子，可用于重现犯罪现场和进行古生物学分析。但由于是很长的线性分子（如人的染色体DNA平均长度为100150Mb）而且缺乏横向的稳定性，因此很容易断裂。在溶液中，由于碱基堆砌力的相互作用与磷酸基团的静电排斥作用，DNA分子非常粘稠，沉淀后很难溶解，而且也增加了它对剪切力的敏感性。即便是最轻柔的方式，高分子量的DNA也很容易因剪切力发生横向的断裂。常规方法分离基因组DNA时，大于150kb的DNA分子很容易发生断裂。（一）酚抽提法 本法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通过改进，以含EDTA、SDS及无DNA酶的
2、RNA酶的裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要行透析或沉淀处理，获得所需的DNA样品。其中，EDTA为二价金属离子螯合剂，可以抑制DNA酶的活性，同时降低细胞膜的稳定性；SDS为生物阴离子去垢剂，主要引起细胞膜的降解并能乳化脂质和蛋白质，与这些脂质和蛋白质的结合可以使它们沉淀，其非极性端与膜磷脂结合，极性端使蛋白质变性、解聚，所以SDS同时还有降解DNA酶的作用；无DNA酶的RNA酶可以有效水解RNA，而避免DNA的消化；蛋白酶K则有水解蛋白质的作用，可以消化DNA酶、DNA上的蛋白质，也有裂解细胞的作用；酚可以使蛋白
3、质变性沉淀，也抑制DNA酶的活性；pH8.0的Tris溶液能保证抽提后DNA进入水相，而避免滞留于蛋白质层。多次抽提可提高DNA的纯度。一般在第三次抽提后，移出含DNA的水相，作透析或沉淀处理。透析处理能减少对DNA的剪切效应，因此可以得到200kb的高分子量DNA。沉淀处理常以醋酸铵为盐类，用2倍体积的无水乙醇沉淀，并用70%的乙醇洗涤，最后得到的DNA大小在100kb150kb。 运用该法可以从单层或悬浮培养细胞、新鲜组织及血液标本中制备少于10mg至大到数百mg的DNA样品。由于分离纯化的每一步都有剪切力的影响，最后得到的DNA样品中分子量超过100kb150kb的很少，但这种大小的DN
4、A足以作为PCR反应的模板和进行Southern blotting分析以及构建以噬菌体为载体的基因组DNA文库。从5107个培养的非整倍体哺乳动物细胞（如HeLa细胞）大约可以制备分子量在100kb150kb的DNA 200mg，自20ml血液可得250mg。（二）甲酰胺解聚法 为构建高容量载体的DNA文库和进行分子量巨大的DNA片段的脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）分析，需要制备分子量大于200kb的DNA。该法的细胞裂解与蛋白质水解同酚抽提法相似，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合物（即染色质），然后通
5、过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶和有机溶剂。甲酰胺是一种离子化溶剂，既可以裂解蛋白质与DNA的复合物，还可使释放的蛋白质变性。但甲酰胺对蛋白酶K的活性无显著影响。本法因操作步骤少，尤其省却了酚的多次提取，所得DNA分子量一般可以大于200kb。（三）玻棒缠绕法缠绕法适于同时从不同的细胞或组织标本中提取DNA。与前两个方案不同，它有两个关键步骤：一是基因组DNA沉淀于细胞裂解液与乙醇液的交界面；二是要将沉淀的DNA缠绕于带钩玻棒上。通过带钩玻棒将高分子量DNA沉淀从乙醇溶液中转移到pH8.0的TE溶液重溶。小的DNA片段与RNA不能有效形成凝胶状线卷。该方案以盐酸胍裂解细胞，制备的DNA分子量只
6、有大约80kb，不能有效构建基因组DNA文库，但用于Southern杂交和PCR反应可以获得很好的结果。（四）DNA样品的进一步纯化纯化的方法包括透析、层析、电泳及选择性沉淀等。其中电泳法简单、快速、易于操作、分辨率高、灵敏度好、易于观察及便于回收，在DNA的进一步纯化中占有重要的地位。由于聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）与琼脂糖凝胶（agarose gel）可以制成各种形状、大小和孔径不一的支持体，并可以在多种装置中进行电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）与琼脂糖凝胶电泳（AGE）广泛用于核酸的分离、纯化与鉴定。二、DNA片段的回收通过凝胶电泳，我们可以对各种大小与来源
7、的DNA片段进行分离、纯化与鉴定。目前，琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶是最常使用的电泳支持体，电泳分离的DNA处于凝胶的三维网状结构中。下面介绍从琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段的主要方法。（一）总的原则与要求 无论采用何种方法从何种支持介质中回收DNA片段，都要注意两个原则。一是要提高DNA片段的回收率；二是要去除回收DNA样品中的污染。回收的DNA样品往往因支持介质的不纯、回收溶液的使用及不慎操作等因素而引入污染，这些污染可能严重影响后继的实验。根据实验要求，应对回收的DNA样品进行纯化，以除去污染物。常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品化的柱层析法。其中柱层析法采用阴离子交换层析
8、的原理，主要是利用带负电荷的DNA在低离子强度的缓冲液中与阴离子交换树脂结合，洗去杂质，然后再用高离子强度的缓冲液洗脱下来。上述两种纯化方法以及其它回收DNA片段的方法，最终均要在有盐的情况下进行乙醇沉淀，并以70%的乙醇除去有机分子与共沉淀的盐。（二）从琼脂糖凝胶中回收DNA片段 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法主要包括二乙基氨基乙基（diethyl aminoethyl，DEAE）纤维素膜插片电泳法、电泳洗脱法、冷冻挤压法及低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法等。1DEAE纤维素膜插片电泳法 DEAE纤维素是一种阴离子交换纤维素，可以结合带负电荷的DNA分子。将DEAE纤维素膜插入到经琼脂糖凝胶电
9、泳分离的核酸条带前，继续电泳直至所需回收的DNA片段刚好转移到膜上。取出DEAE纤维素膜，低盐条件下洗去杂质，高盐条件下洗出DNA分子。该法操作比较简单，可同时回收多个DNA片段，对500bp5kb的DNA片段回收率好，纯度高，能满足大多数实验的要求。但DNA片段大于5kb时，因结合力增大而回收率下降。至10kb或为单链DNA时，其与膜的结合变得很牢固而难以回收。因此，本法不适合于分子量大于10kb的DNA片段的回收，也不能回收单链DNA。2电泳洗脱法 电泳洗脱法包括两个主要步骤，一是将待回收的DNA片段电泳出凝胶介质，使其进入一个便于回收的小容积溶液中；二是分离纯化出DNA片段。按是否使用透
10、析袋可分为透析袋电泳洗脱法与非透析袋电泳洗脱法两大类。其中，透析袋电泳洗脱法需要切下含待回收DNA片段的凝胶条，然后放入透析袋内进行电泳，使DNA分子迁移出凝胶条进入透析袋的溶液中，最后经抽提纯化回收DNA分子。该法操作很不方便而且不适合于同时回收大量不同的DNA片段，但可有效回收从200bp至大于50kb的DNA，尤其对大于5kb的DNA有良好的回收率。3低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法 该法是从低熔点琼脂糖凝胶中切出含待回收DNA的凝胶块，利用其纯度高、熔点低（65）及凝固温度低（30）的特点，在室温大于30，琼脂糖仍为液态的情况下，对DNA片段进行回收的方法。根据不同的提取纯化方案，又可分为有
11、机试剂提取法、玻璃珠（或玻璃粉）洗脱法和琼脂水解酶（agarase）法。有机试剂法以酚、氯仿抽提DNA，可以有效回收0.5kb5kb的DNA片段。玻璃珠（或玻璃粉）洗脱法是将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠（NaI）溶液或高氯酸钠溶液中，然后加入玻璃珠（或玻璃粉）以结合DNA，经分离、洗涤后，在低盐缓冲液中将DNA洗脱下来。玻璃珠（或玻璃粉）洗脱法较有机试剂提取法快，但回收率略低。琼脂水解酶法对切下的含DNA的凝胶块进行消化，将琼脂糖水解为二糖，释放的DNA用酚抽提，乙醇沉淀回收。 目前，有许多能从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法与改良方案，但至今尚无一种方法既能有效回收DNA大片段或微量的DNA
12、片段，又能同时回收几种DNA片段并有效去除凝胶中酶促反应抑制剂（如多糖类）。每种方法各有其特点，各有其适用范围，应根据不同的要求选择不同的方法并对某些步骤做出相应的调整。（三）从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA的标准方法是压碎与浸泡法。它是将含待回收DNA条带的凝胶块切出，用吸头或接种针将其压碎，然后以洗脱缓冲液浸泡，使DNA洗脱出来。该法能很好回收小于1kb的单链或者双链DNA，且纯度很高，无酶抑制剂，也无对转染细胞或微注射细胞有毒的污染物，虽费时但操作简单，是小片段DNA回收的较好方法。依分子量不同，其回收率从小于30%至大于90%不等。如果将切下的聚丙烯酰胺凝胶块包埋于琼脂糖凝胶中，再进行DEAE纤维素膜插片法电泳或透析袋电泳洗脱，可以缩短双链DNA的回收时间。 三、基因组DNA分离纯化的方法学评价与质量保证 有关基因组DNA分离纯化的方法很多，每一种方法下又可衍生出许多具体的实验方案。对每一个具体的实验方案，大体上我们可以从方法的可行性与可靠性两个方面来加以考察。可行性方面包括方法是否简便、快速、安全及成本如何。可靠性则包括了方法的稳定性、重复性、特异性、产出比、最大产量及最小样品用量等。另一方面，由于酚具有高度的腐蚀性，需要采取特别的安全防护措施。
