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1、麓国翁掺I 垦坚窨犁蓄裔裂燃术交易大会 新抗菌肽功能及应用研究进展 一以乳铁蛋白肽L a c t o f e r r i c i n 为例 王建华冯兴军田子罡杨雅麟滕达 ( 中国农业科学院饲料研究所基因工程研究室，北京10 0 0 8 1 ) 传统抗生素在人畜预防和临床医学领域长期应用，尤其是饲料中预防性抗生素的全面 使用在一定程度与范围几达滥用之嫌，由此带来的人和动物药残和病原菌耐药性形成与发 展等问题日益尖锐，使得曾经几乎万能的抗生素的功过是非饱受争议。与此同时对诸如抗 生素肽等新产品研发已经成为目前世界热点和难点课题。本文综合述评新型抗菌肽生物学 功能与作为临床用或预防用抗生素的应用研究
2、进展。 1 、抗菌肽与L f c i n B 的发现 抗菌肽是宿主防御系统产生的类对抗外界病原体感染的肽类物质，是宿主免疫防御 系统的重要组成部分( P a p a g i a n n i ，2 0 0 3 ) 。抗菌肽抗菌广谱，对病毒、寄生虫、癌细胞均 有抑制作用。天然的抗菌肽通常是由十几个至几十个氨基酸残基组成的小分子多肽，多小 于1 0k D a ，含多个带正电荷的氨基酸如赖氨酸( L y s ) 或精氨酸( A r g ) ，多数抗菌肽p I 大于7 ，表现出强阳离子性，N 端亲水，C 端疏水具有双亲性，水溶性和热稳定性好，对 高离子强度和p H 值均具有较强的抗性。此外部分抗菌肽具备
3、抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水 解的能力，例如牛乳铁蛋白肽B o v i n eL a c t o f e r r i c i n 。抗菌肽由基因编码、核糖体合成 ( R e d d y 等，2 0 0 4 ) ，或由大分子功能蛋白降解形成。 B o m a n 小组首次通过对滞育的天蚕H y a l o p h o r ac e c r o p i a 蛹注入E s c h e r i c h i ac o l i ， 诱导蚕蛹血淋巴分离出两种低分子量的具有极强抗菌活性的肽类物质( H u l t m a r k 等， 1 9 8 0 ) 。后霍夫曼等证实了这些肽的存在，先用细菌培养液注射昆虫，1
4、 2 至2 4 h 后昆虫产 生了大量的肽类抗菌物。S t e i n e r 等在N a t u r e 上公布了该类肽的一级结构并正式命名为天 蚕素C e c r o p i n s ( S t e i n e r 等，1 9 8 1 ) 。迄今，已从动物不同组织中分离并鉴定出1 0 0 多种抗 菌肽。 前面提到的乳铁蛋白活性多肽( L a c t o f e r r i c i n ，简写为L f c i n ) 是1 5 年前发现的一种 新型抗菌肽。L f c i n 具有多种生理活性，是乳铁蛋白活性中心，具有抑菌杀菌、抗癌、调节 免疫、抗病毒等多种乳铁蛋白所具有的生物学功能。A b
5、e 等( 1 9 9 1 ) 在研究酸性条件下乳铁 蛋白( L F ) 的热稳定性时发现，经热处理后L F 发生明显的降解，但抑菌活性却强于未经 4 0 新抗菌肽功能及应用研究进展i 论文集i 热处理的L F ，于是推测在L F 力I I 热降解后产生了抑菌活性强于L F 的多肽。T o m i t a 等( 1 9 9 1 ) 研究了牛L F 经蛋白酶降解后产生的多肽的抗菌作用，结果表明，猪胰蛋白酶水解所得小 分子多肽抗菌活性显著提高，具有广谱抗菌活性，能抑制多种G + 和G 一细菌生长，其中包 括对L F 具有抗性的菌株，且迄今未发现病原菌对其耐药性的报道。B e l l a m y 等(
6、 1 9 9 2 a ) 在牛L F 的胃蛋白酶解产物中分离得到一段N 端多肽，其抗菌活性比L F 强4 0 0 多倍，将其 命名为L a c t o f e r r i c i n ( 简写为L f c i n ) ，此后，相继在人、小鼠、山羊和猪( S t r o m 等，2 0 0 2 ) 等动物L F 中发现L f c i n 同源物。其中，由于牛L f c i n ( L f c i n B ) 抗菌活性最强而成为研究 热点。L f c i n B 来源于牛乳铁蛋白的1 7 - 4 1 位A A ，由2 5 个A A 残基组成，A A 顺序为P h e L 研卜C ) 铲A r g
7、A r g 一玲C m 一玲A r g M e t L y S L 矿L 舢一G l y A h P m S e 卜e T h r _ C y s V a l A r g A r g A l a P h e ( B e l l a m y 等，1 9 9 2 b ) 。作者小组近几年对L f c i n 的作用机 制( 冯兴军等，2 0 0 4 ) 、融合表达研究( F e n g 等，2 0 0 5 ；田子罡，2 0 0 6 ) 以及包含有此新 型抗菌肽在内的肽类抗生素的转基因表达策略探讨( 冯兴军等，2 0 0 6 ) 分别有专门报道或 论述。 2 、L f c i n B 生物学功能 2
8、 1 抑菌与杀菌 L f c i n 抗菌广谱，包括许多G + 和G 一病原菌，例如大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、绿脓杆 菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌等，与牛乳铁蛋白相比，L f c i n B 的抗菌活性提高了4 0 0 多倍( B e H a m y 等，1 9 9 2 b ) 。除对原核细胞作用外，L f c i n B 对真核微生物如霉菌、酵母也 具有抑制作用。实验表明，L f c i n B 及其衍生物能够抑制培养基中毛癣菌( T r i c h o p h y t o n ) 、 白色念球菌( C a n d i d aa l b i c a n s ) 等真菌病原体的繁殖，抑制其菌
9、丝生长，口服L f c i n B 能 够改善动物感染毛癣菌病状，缩短治愈时间( W a k a b a y a s h i 等，1 9 9 9 b ；2 0 0 0 ) 。L f c i n B 对 包括真菌在内的微生物均有抑制作用，除个别G + 外，生长在1 蛋白胨培养基或S a b o u r a u d 葡萄糖培养基的真菌、G + 和G 一在较低L f c i n B 浓度下不能生长，M I C 为1 0 “g m l 左右 ( 唐传核等，2 0 0 0 ) 。B e l l a m y 等( 1 9 9 2 b ) 研究了2 8 种菌株对L f c i n B 的敏感性，所选待测 菌
10、株包括G + 和G 一、杆菌和球菌、专性需氧菌、兼性厌氧菌和专性厌氧菌，测定了在蛋白 胨基础培养基( 细菌蛋白胨1 0g L ) 和Y P G 培养基( 细菌蛋白胨1 0g L ；酵母浸膏0 5g L ； 葡萄糖1 0g L ) 上L f c i n B 的有效抑菌质量浓度，结果表明，随菌株和培养基变化，有效抑 菌质量浓度范围为0 6 1 5 0 “g m L ，并发现G + 对L f c i n B 比G 一更为敏感。 L f c i n 抗菌活性受多种因素影响。L f c i n 属阳离子型抗菌肽，靠静电作用与微生物质膜 结合，在这一过程中离子性反应起着至关重要的作用。因此，影响L f c
11、 i n 与质膜间离子性 反应的因素就可能影g N L f c i n 的抗菌活性，例如提高溶液中C a 2 + 、M 9 2 + 等阳离子的离子强 度、增加T r i s 、H e p e s 、P I P E S 缓冲液浓度，都会显著降低L f c i n 抗菌效果。此外，培养基、 菌株不同对L f c i n 的抗菌活性也有一定影响( B e l l a m y 等，1 9 9 2 b ；许时婴等，2 0 0 1 ) 。 2 0 0 6蓄杳蓉委臂燃术交易大会 2 2 抗寄生虫 T u r c h a n y 等( 1 9 9 5 ) 研究发现，L f c i n B 和L f c i n
12、 H 能够抑制贾第鞭毛虫的生长，杀死 培养基中的贾第鞭毛虫。与L F 相比，虽然L f c i n B 和L f c i n H 不能与F e 3 + 结合，但F e 3 + 能 够减弱L f c i n B 和L f c i n H 对贾第鞭毛虫的抑制作用；T u r c h a n y 等( 1 9 9 7 ) 通过进一步研究 证实，F e s + 能够抑制L F 或L f c i n 与贾第鞭毛虫的结合，表明L f c i n 对贾第鞭毛虫的抑制作 用不仅与贾第鞭毛虫的铁利用有关。 T a n a k a 等( 19 9 5 ) 研究发现L f c i n B 对体外环境下的鼠弓形体(
13、T o x o p l a s mg o n d i i ) 具抑制作用。O m a t a 等( 2 0 0 1 ) 进一步实验发现，小鼠胚胎细胞与经L f c i n B 处理后弓形体 的孢子共同培养，细胞存活率显著高于对照组；此外，将L f c i n B 处理的兔肝艾美尔球菌 ( E i m e r i as t i e d a f ) 。的合子感染体外培养的兔肝脏细胞，也得到了相同的结果。实验表明， L f c i n B 可有效减弱弓形体、兔肝艾美尔球菌等病原虫对宿主细胞的感染力。对于感染弓形 体的小鼠，每天饲喂5 0m g 或皮下注射0 1m gL f c i n B 实验组小鼠
14、无一死亡，而对照组 死亡率达8 0 ，同时，两处理组小鼠脑组织中感染的寄生虫量也明显低于对照组，结果表 明L f c i n B 能有效抵制弓形体对小鼠的侵染。 2 。3 抗病毒 L f c i n B 可降低细胞巨化病毒和H I V ( B e r k h o u t 等，2 0 0 2 ) 、疱疹1 型和2 型病毒( J e n s s e n 等，2 0 0 4 ) 、腺病毒( D iB i a s e 等，2 0 0 3 ) 、轮状病毒( S u p e r t i 等，2 0 0 3 ) 、脊髓灰质炎病 毒和猫嵌杯样病毒( M c C a n n 等，2 0 0 3 ) 等对宿主细胞
15、的感染力，抑制病毒颗粒复制，如 通过结合细胞膜硫酸乙酰肝素( H S ) 封闭疱疹病毒的结合受体，抑制疱疹病毒对细胞的感 染，通过封闭C X C R 4 或C C R 5 受体抑制H I V 对宿主细胞的吸附，最新研究认为L f c i n 所 带正电荷、疏水基团和环状结构等因素都与其抗病毒“吸附一封闭”机制( M c C a n n 等， 2 0 0 3 ；A n d e r s o n 等，2 0 0 3 ) 有关。 2 4 抗癌 体外研究表明，L f c i n B 对转化细胞具有细胞毒作用，能抑制T H P - 1 人单核白血病细 胞( Y o o 等，1 9 9 7 ) 、人白血病细
16、胞H L - 6 0 ( R o y 等，2 0 0 2 ) 增殖及生长发育，启动肿瘤 细胞凋亡程序，增加细胞内活性氧水平，提高C a z + M g z + 依赖性核酸内切酶活性，导致细 胞形态异常、染色体凝集、D N A 片段化、凋亡小体等细胞凋亡特征的出现，最终杀死癌细 胞。此外，研究发现，小鼠皮下注射L f c i n B 能够抑制黑色素瘤细胞及淋巴瘤细胞的转移 ( Y o o 等，1 9 9 8 ) 。 2 5 调节免疫与消炎 蛋白质或多肽在初生哺乳动物消化道内可以被完整吸收并转远在正常动物或人消化 道中，酶解释放的游离氨基酸经钠泵或非钠泵吸收，二肽或三肽由特异性转运载体吸收，3 肽以上的多肽很难被消化道以非特异性吸收形式进入血液。因此，口服L f c i n ( 2 5 A A ) 能 调节动物机体免疫水平分子、辅助杀死体内致病细菌、原虫或病毒( I s a m i d a 等，1 9 9 8 ； 新抗菌肽功能及应用研究进展l 论文集l O m a t a 等，2 0 0 1 ；W a k a b
