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1、巯基乙胺修饰电极法测定植物体内超氧阴离子自由基 王 燕 * 陈蓁蓁 (山东师范大学化学化工与材料科学学院, 济南 250014) 摘 要 盐酸羟胺与超氧阴离子自由基反应生成 NO - 2, 通过检测 NO - 2 的生成量, 可间接测定超氧阴离子自 由基。基于上述原理, 建立了一种用巯基乙胺自组装修饰金电极测定生物体系中超氧阴离子自由基的新方 法。实验结果表明, 在 pH 4 . 8的 HAc -Na A c缓冲溶液中, 修饰电极对 NO - 2 的氧化具有良好的电催化作用, 差 分脉冲溶出伏安法测定其氧化峰电流与 NO- 2 的浓度在 5. 0 10- 8 1. 0 10- 4mol/L范围
2、内呈线性关系, 其 线性回归方程为 ipa(LA) = 3. 726C(Lmol/L) + 0. 0257 , 相关系数为 0. 9983; 检出限为 1. 0 10- 8mol/L 。该法 用于玉米幼苗和叶片中超氧阴离子自由基产生速率的测定, 结果令人满意。 关键词 超氧阴离子自由基, 化学修饰电极, 巯基乙胺, 差分脉冲溶出伏安法 2008-04 -02收稿; 2008-05 -28接受 本文系山东省自然科学基金 (No. Y2006B28)资助项目 *E-mai: lfagong sdu . edu . cn 1 引 言 在生物体的氧化代谢过程中会产生大量的活性氧自由基, 它们具有很强的
3、氧化能力, 可以损伤生物 膜的结构及功能, 引起核酸及蛋白质变性, 从而对细胞及组织产生十分有害的生物学效应。其中超氧阴 离子自由基 ( O2 # - )是生物体中第一个生成的氧自由基, 它既能与体内的活性物质直接作用, 又能经过 一系列反应转化生成 H2O2、 羟自由基 (#OH )、 单线态氧 ( 1O 2)等其它的氧自由基, 具有更大的危害性, 可 引起各类疾病 1。因此, 生物体系中超氧阴离子自由基的检测, 对于研究自由基的生物学作用及其清除 机理具有重要意义。 目前超氧阴离子自由基的检测方法有电子自旋共振法、 荧光法、 光度法、 电化学法和化学发光法 等 2 7。其中电子自旋共振及化
4、学发光法需要特殊的仪器及操作条件。邻苯三酚法等可见吸光光度法 虽然应用广泛, 但干扰因素多, 检测灵敏度较低。荧光法虽然提高了灵敏度, 但需要合成特殊的荧光试 剂而且步骤繁琐, 不适于常规应用。电化学法一般可分为酶电极直接安培测定法 6 和极谱氧电极间接 测定法 7两大类。其中酶电极法选择性好、 灵敏度高, 但电极寿命短、 造价高。本研究提出了一种化学 修饰电极间接检测生物体系中超氧阴离子自由基的新方法。基于盐酸羟胺被超氧阴离子自由基氧化为 NO - 2的反应, 用巯基乙胺自组装修饰金电极检测 NO - 2的生成量, 可间接测定超氧阴离子自由基。 研究了巯基乙胺修饰电极对 NO - 2的电催化
5、作用, 确立了测定 NO - 2的最佳实验条件及线性方程。 结果表明, 与其它测定 NO - 2的修饰电极 8相比, 该修饰电极选择性好、 灵敏度高、 电极寿命长、 生物相 容性好, 特别适于生物体系中超氧阴离子自由基的检测。通过差分脉冲溶出伏安法检测 NO - 2氧化峰电 流的变化, 间接测定了玉米幼苗和叶片中超氧阴离子自由基的产生速率。本方法具有仪器简单、 操作简 便、 药剂价廉等特点, 为研究超氧阴离子自由基在植物老化过程及对环境胁迫信号的感受、 传导与适应 过程中所起的重要作用, 提供了一种准确可靠的测定方法, 具有一定的应用价值。 2 实验部分 2 . 1 仪器与试剂 LK98A微机
6、电化学分析仪 (天津市兰力科化学电子高技术有限公司 ); p HS-3C型酸度计 (上海雷磁 仪器厂 ); KQ-100DE型数据超声波清洗器 (昆山市超生仪器有限公司 ); 三电极体系: 自组装金盘电极 ( = 3mm)为工作电极, 铂片为对电极, 饱和甘汞电极为参比电极; 恒温水浴锅; 高速离心机 (上海雷磁 仪器厂 )。 第 36卷 2008年 11月 分析化学 (FENXIHUAXUE) 研究报告 Chinese JournalofAnalyticalChemistry 第 11期 1505 1509 巯基乙胺 ( Sigma公司, USA); 0 . 2 mol/L HAc -Na
7、Ac缓冲溶液; 6 . 5 10 - 2 mol/L PBS ( p H = 7 . 8 ; 0101mol/L NO - 2储备液; 0 . 05mol/L盐酸羟胺溶液。其它试剂均为分析纯。实验用水为二次亚沸石英 蒸馏水。实验所用玉米叶片等植物样品由山东师范大学生命科学学院逆境植物实验室提供。 2 . 2 巯基乙胺自组装修饰金电极的制备 金盘电极在金相砂纸上打磨后依次用 0 . 3 、 0 . 05 L m A l2O3抛光, 然后用水超声清洗 10m in后取出, 置于 0 . 5 mol/L H2SO4溶液中在 - 0 . 2 1 . 5V电位范围内进行循环伏安扫描 ( 100mV /s
8、, 10m in)。将 处理好的金电极置于 5 . 0 10 - 3 mol/L 巯基乙胺水溶液中进行自组装, 12 h后取出, 即可得到巯基乙胺 单分子层修饰金电极。用水超声清洗 5m in后备用。 2 . 3 NO - 2的测定 将三电极体系插入含 0 . 2mol/L HAc -NaAc缓冲溶液和一定量的 NO - 2溶液中, 通氮除氧 15m in , 在 0 . 60V电位下搅拌富集 150 s , 静置 30 s, 在 0 . 40 1 . 20 V电位范围内以脉冲幅度 30 mV, 脉冲宽度 100ms, 电位增量 3mV, 间隔 0 . 1 s的条件下进行差分脉冲溶出伏安法测定
9、。 2 . 4 样品的制备 9 称取玉米幼苗或叶片等植物材料 1 . 00 g, 加入 3 . 00 mL( 6 . 5 10 - 2 mol/L) PBS及少许石英砂, 充 分研磨后转入离心管中并于 10000 r/m in离心 15 m in, 取上清液并定容至 3 . 00mL, 此液即为植物 O2 # - 提取液。 2 . 5 实验方法 在 1 . 00mL样品提取液中加入 1 . 00 mL( 6 . 5 10 - 2 mol/L) PBS+ 0 . 20 mL( 0 . 01 mo1/L)盐酸羟胺 溶液, 摇匀, 于 25 e 水浴中加热 20 m in 。然后取一定量上述溶液加入
10、 HAc -NaAc缓冲溶液中, 用上述方 法测定其中 NO - 2浓度, 然后换算求出样品中 O2 # - 含量。 3 结果与讨论 3 . 1 NO - 2在巯基乙胺自组装修饰金电极上的电化学行为 图 1为金电极修饰前后的循环伏安图。0 . 60和 1 . 26 V处分别为裸金电极表面金氧化物的还原峰 和形成金氧化物的氧化峰 (图 1B)。当巯基乙胺修饰于金电极表面后, Au的氧化峰电位负移至 1 . 14 V, 还原峰电位不变 (图 1A), 表明修饰层具有电子媒介体的作用, 加快了电极界面的电子转移速度, 因而 它对金电极表面氧化物的氧化过程具有催化作用 10。 图 2为 4 . 0 1
11、0 - 5 mol/L NO - 2在修饰电极 ( A)及裸电极 ( B)上的循环伏安图。从图 2可以看出, NO - 2在两种电极上均出现一个氧化电流峰, 呈现出不可逆电极反应的特征。在裸金电极和巯基乙胺修 饰金电极上得到氧化峰电位分别为 0 . 93和 0180V。在修饰电极上 NO - 2的氧化峰电位比在裸金电极上 图 1 巯基乙胺修饰金电极 ( A)和裸金电极 ( B)的循环 伏安图 Fig . 1 Cyclicvoltammogra ms of mercaptoethyla m ine modified gold electrode (A ) and bare gold electr
12、ode (B) HAc-NaAc缓冲溶液 ( buffer solution): pH= 4. 8, v: 100 mV /s 。 图 2 NO - 2 在巯基乙胺修饰金电极 (A )和裸金电极 ( B)上的循环伏安图 Fig . 2 Cyclic volta mmogra ms ofNO- 2 atmercaptoethylamine modified gold electrode (A) and bare gold electrode (B) 4 . 0 10- 5mol/L NO- 2, HA c -NaA c缓冲溶液 ( buffer solution): p H = 4. 8 , v
13、: 100 mV /s 。 1506 分 析 化 学第 36卷 负移近 130mV, 而且氧化峰电流显著增大, 表明修饰电极对 NO - 2的氧化具有明显的电催化作用。 通过研究扫描速度对峰电流的影响, 得到 NO - 2的 ipa与 v在 20 250mV /s范围内呈线性关系, 其线 性回归方程为:ipa( LA) = 0 . 2984v( mV /s) + 7 . 788 , 相关系数 r= 0 . 9989 , 表明电极反应过程是受 NO - 2 在修饰电极上的吸附作用所控制。根据公式 11 ipa= n 2F2vA# 0/4RT, 以 ipa对 v作图, 由直线的斜率可计 算出 NO
14、 - 2在电极表面的吸附量 #0= 2 . 47 10 - 10mol/cm2。这一数值表明: NO- 2在修饰电极上为单分 子层吸附 12。 根据实验结果推测此电化学过程的可能机理是: 巯基乙胺分子的末端集团 NH2是亲水性基团, 可 以使电极表面的亲水性增加, 从而使异相界面的电子转移速度加快, 致使 NO - 2氧化反应的可逆性变好; 此外, NH2有一定的碱性, 巯基乙胺自组装膜的表面 p Kb为 2 . 4 10, 在 p H 4 . 8的水溶液中, 巯基乙胺 中氮原子的孤对电子与 H + 结合成阳离子, 使修饰电极表面带有密度较高的正电荷, 对 NO - 2阴离子具 有较强的静电吸
15、引作用, 使溶液中的 NO - 2吸附富集在电极表面, 有利于 NO - 2在电极表面的氧化。 3 . 2 底液的选择 分别实验了以 0. 1 mol/L HCl 、HAc -NaAc 、 KH2PO4-K2HPO4、 0 . 1 mol/L KNO3、 0 . 1 mol/L H2SO4、 B-R缓冲液为底液时 NO - 2的电化学响应情况。结果表明, 在 H2SO4、 B-R缓冲液和 HAc -Na Ac缓冲液中 出现 NO - 2的氧化电流峰, 而且在 HAc-Na Ac缓冲液中峰形最好、 响应信号最灵敏。改变 HAc -NaAc缓 冲溶液的 p H 值, 在 pH 3 . 6 5 .
16、2范围内变化,p H = 4 . 8时峰形最好, 峰电流最大。因此, 本实验选用 p H = 4 . 8的 HAc -NaAc缓冲溶液作底液。 3 . 3 富集条件的选择 将修饰电极置于 4 . 0 10 - 5mol/L NO- 2溶液中, 在 - 0 . 2 1 . 6 V电位范围内改变电位进行富集。 结果表明: 随着电位增大峰电流增高, 在 0 . 6 V富集可得到最大峰电流, 之后随着电位增大峰电流减小。 因此, 本实验选择 0. 6V为富集电位。固定富集电位为 0 . 6 V, 改变富集时间。随着富集时间的延长峰 电流随之增大。富集时间为 150 s时峰电流达到最大, 之后随着富集时间增加, 峰电流不再增大。所以 富集时间选择为 150 s 。 3 . 4 线性范围与检出限 为了得到较好的灵敏度和重现性, 选用差分脉冲溶出伏安法 ( DPSV)定量测定 NO - 2。如图 3所示, 在最佳实验条件下, NO - 2的 ipa与其浓度在 5 . 0 10 - 8
