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1、? 农 业 生 物 技 术 学 报Journal of Agricultural Biotechnology1999, 7( 3) ? ? 夏? 春: 男, 副教授 E -mail: xiachun public. east. net. cn ? 收稿日期: 1998 -12 -16 拉布拉多犬和德国牧羊犬干扰素 alpha 基因克隆及测序 夏? 春? 汪? 明? 夏兆飞 (中国农业大学动物医学院, 北京 100094) ? ? 摘? 要: 本研究采用 PCR 技术扩增和克隆了拉布拉多犬和德国牧羊犬的干扰素基因alpha IFN。测序 结果显示拉布拉多犬和德国牧羊犬的 alpha IFN 基因
2、序列一致, 全长均为513 个核苷酸, 共编码170 个氨基 酸。两种犬 alpha IFN 蛋白分子量均为 18?504 kD。结果也揭示了犬属动物的 alpha IFN 基因十分保守, 仅 存在 0?3% 的变异。 关键词: 犬; 干扰素基因; PCR 法 Molecular Cloning of Interferon -alpha Genes from Two kinds of Dog ( Labrader Retriever and German Shepherd Dog) Xia Chun? Wang Ming ? Xia Zhaofei (College of Veterinary
3、 Medicine, China Agricultural University, Beijing 100094) Abstract: T wo alpha IFN genes were isolated from Labrader Retriever and German Shepherd dog by PCR us - ing primers based on highly conserved amino acid sequence blocks of dog s alpha IFN genes. T he cloned IFN genes between Labrader Retriev
4、er and German Shepherd dog are similarities, and are 513 nucleotides long and deduced 170 amino acid. T his data would suggest the alpha IFNs of dog be highly conserved, and the amino acid sequences have 99?3% 100% homology with those of dogs alpha IFN genes. Key words: dog; interferon gene; PCR met
5、hod ? ? 干扰素( Interferon, 缩写为 IFN) 是一类能诱导动物细胞产生多种广谱抗病毒蛋白的细胞因子, 具 有阻止病毒繁殖、 调节机体免疫反应的生物学功能, 是当今应用前景广阔的重要生物制剂之一 1。80 年代中期, 人的干扰素基因克隆成功, 抗病毒与抑制肿瘤的效果十分显著 2。随后, 犬 3、 猪、 猫和鸡的 干扰素基因相继克隆成功, 并正在向临床应用过渡4 7。我国于 90 年代初开始了人干扰素的研究, 畜、 禽尤其是伴侣动物干扰素的分子生物学研究尚未见报道。 近年来, 犬作为伴侣动物的饲养正在兴起。而犬类各种病毒性疾病是造成死亡的最重要病因。干 扰素对病毒不仅具有广谱
6、、 特效的抗病毒感染作用。为了研制犬干扰素生物制剂, 我们进行了两种犬干 扰素基因的克隆与测序。 1 ? 材料与方法 1?1? 基因组 DNA 提取? 从拉布拉多犬( Labrader Retriever) 和德国牧羊犬( German Shepherd Dog) 两 种犬动脉采血, 参照 Sambrook 等8方法从血细胞中提取基因组 DNA。 1?2? 引物设计 ? 从 DDBJ 读取株犬属( Canis familiaris) 干扰素基因, 其序号分别为 A33691、 A33693、 M28624、M28625 和 M28626。采用 Oligo 5?0 软件在基因序列的上、 下游各设
7、计一引物。引物对内包 含有 IFN 基因全序列。上游引物序列为 5ACTCCCTGT GCTGTCTGGCT TG3, 下游引物序列为 5 T CATTTCCT CCTCCTGATTCTTTC3。 1?3? PCR反应? 首先采用 Taq PCR 试剂盒( Promega 公司) 进行基因扩增。PCR 反应中含犬基因组 DNA 2?L( l? g) , 上、 下游引物各加 100 pmol, 总体积为 50?L。反应条件为 94 ? 热变性 1 min、 55? 退火 1 min、 72? 延伸 1 min。PCR反应均在HYBAID 公司的 PCRSprint 仪进行 32 个循环, 最后一
8、循环后于 72? 保温 10 min。 1?4? 基因测序 ? PCR 产物经 1?5% 低溶点琼脂糖电泳后, 切割下 0?5 kb 处的 DNA 带, 再与 T-Easy 载 体( Promega 公司) 连接, 转化XL -F感受态细胞( Stratagene 公司) , 筛选白斑、 酶切鉴定。最后, 采用 Wiz - ard试剂盒( Promega 公司) 提纯重组质粒。随后, 使用 T7 和 SP6 引物、 用 ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit 在 ABI 377 型 DNA 自动测序仪( Perkin E
9、lmer 公司) 测定克隆双向序列。 测序结果的连接和序列分析均采用 GENETYX 7?3 软件进行。 图 1 PCR 产物电泳 Fig. 1 Specificity of PCR 1 拉布拉多犬 2 PCR Marker (promega) 3 德国牧羊犬 Line 1 Labrader Retriever line 2 PCR Marker ( promega) line 3 German Shepherd Dog 2 ? 结果与讨论 2?1? PCR 结果 ? PCR 产物经琼脂糖电泳后, 如图 1 所示。拉布拉多犬和德国牧羊犬均在 0?5 kb 处有一条清晰、 特异的 DNA 带。这
10、与 alpha IFN 基因大小相符。初步确定为 alpha IFN 基因。 2?2? 基因序列 ? 分别测序拉布拉多犬和德国 牧羊犬 DNA 带结果如图 2 所示, 拉布拉多犬和 德国牧羊犬的 alpha IFN 基因全长均为 513 个 核苷 酸, 共 编 码 170 个 氨 基 酸。GC 含 量 60?19%。其中亲水性氨基酸占 29?2%, 疏水性 氨基酸占 44?1% , 中性氨基酸占 29?1%。两种 犬 IFN 蛋白分子量均为 18?504 kD。另外, 在 ORF 中的第 286 位、 325 位、 358 位、 372 位和 477 位分别存在 Ban II、 Pst I、
11、Msi I、 Bsu 361 和 T aq I 限制性内切酶位点。 图 2? 拉布拉多犬和德国牧羊犬 alpha IFN 基因序列 Fig? 2 Nucleotide sequence of alpha IFN gene from Labrader Retriever or German Shepherd Dog The amino acids are denoted under the sequence 246?农 业 生 物 技 术 学 报1999 年? ? ? 人类 IFN 基因分为 I 型和 II 型, I 型 IFN 又分为 ?和 ?等型。?和 ?型 IFN 均为无内含子的单考 贝基
12、因并共用靶细胞表面受体, 具有抗病毒等生物学活性。Himmler 等3报道了犬 alpha IFN 基因序列 并专利控制了该基因的使用, 限制了 IFN 基因的使用范围。本研究采用 PCR 法进行了两种犬的 alpha IFN 基因的克隆, 目的在于寻找新型 alpha IFN 基因用于我国犬类病毒病的治疗。拉布拉多犬和德国 牧羊犬 alpha IFN 基因序列完全一致, 与犬 IFN A3 3的同源性为 99?7% , 与猪、 猫和鸡干扰素基因4 7 的同源性低于 30% 。结果进一步揭示犬属动物 alpha IFN 基因在进化上十分保守, 仅存在约0?3%的变 异。 总之, 本研究克隆了不
13、含信号肽、 可用于原核表达的拉布拉多犬和德国牧羊犬的 alpha IFN 基因。 参? 考? 文? 献 1 Bot A, et al. Protective role of gamma interferon during the recall response to influenza virus. J Virol, 1998, 10(4) : 241 248 2 Gray P W, et al. Expression of human immune interferon cDNA in E Coli and monkey cells. Nature, 1982, 295: 503 508 3
14、 Himmler A, et al. Structure and expression in Escherichia coli of canine interferon -alpha genes. J Interf eron Res, 1987, 7: 173 183 4 Aetrsson K, et al. Molecular cloning of a gene encoding porcine interferon -beta. J Interferon Res, 1992, 12(3): 153 160 5 Iwata A, et al. Cloning and expression o
15、f the canine interferon -beta gene. J Inerferon Cytokine Res, 1996, 16(10) : 765 770 6 Schijns V E, et al. Molecular cloning and expression of cat interferon -gamma. Immunogeneitcs, 1995, 42(5): 440 7 Sick C, et al. A family of genes coding for two serologically distinct chicken interferons. J Biol Chem , 1996, 271(13): 7635 7639 8 Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular cloning: A Laboratory Manual ( cold spring harbor, NY). 2ed ed, 1989: 145 247? 第 3 期?夏? 春等: 拉布拉多犬和德国牧羊犬干扰素 alpha 基因克隆及测序?
