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1、注意:每人答案务必不能完全一样4试述酵母双杂交系统的原理、构建及基本用途。(12 分)第一种答： 酵母双杂交系统 是一项专门用来研究蛋白质与蛋白质相互作用的技术，它首先由 Fields S 和 Song OK 于 1989 年提出。这项新技术在验证已知蛋白质之间的相互作用或筛选与特定靶蛋白呈特异性作用的候选蛋白的研究中已经得到了广泛的应用。其可行性和有效性已被证实，并被推广到了诸如信号传导、细胞周期调控、肿瘤基因表达等多个研究领域，受到越来越多的重视。酵母双杂交系统的原理 酵母双杂交系统技术使用蛋白质的两种具有特别功能的结构域：一种是与 DNA 结合的结合结构域（简称 BD），另一种是激活 D
2、NA转录的激活结构域 （简称 AD）。研究表明，这两种结构域并不需要一定在同一个蛋白质上才起作用。事实上，一个含有 BD 的蛋白质在与另一个含有 AD 的蛋白质结合以后就可以激活转录，该原理构成了酵母双杂交技术的基础。 在双杂交系统中，两种融合蛋白被表达：一种是目标蛋白X，它有时被形象地称为诱饵蛋白。X 在它的 N-端与 BD 融合在一起；另一种是潜在的能够与 X 结合的目标蛋白Y。Y 与 AD 融合在一起。如果 X 与 Y 相互作用，那么 XY 的结合就形成一种完整的活性转录激活物。如此形成的转录激活物能够驱动一个容易检测的报告基因的表达。于是，报告基因的表达量可以用来作为测定 X 与 Y
3、相互作用的尺度。酵母双杂交系统的建立1. 选择载体2. 将“诱饵”蛋白 X 的基因和目标蛋白 Y 的基因分别插入到BD 载体和 AD 载体之中，以形成 BD-X 和 AD-Y 融合蛋白3. 转染：使用特定的手段将重组后的 BD-X 载体和 AD-Y 载体转染到特定的营养缺陷型酵母宿主细胞；4. 筛选：利用双营养缺陷型的恢复筛选出同时含有 BD 载体和AD 载体的细胞；5. 活性检测。 应用：1. 发现新的蛋白质和蛋白质的新功能2. 在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用3. 筛选药物作用位点及药物对蛋白相互作用影响4. 建立基因组蛋白连锁图第二种答：基本原理：酵母的转录活化因子 GLA4 含有两个
4、功能结构域：氨基端的 DNA 结合结构域（BD）和羧基端的转录激活结构域（AD）。它们彼此分开时，各自仍具有各自的功能。Fields 根据此特征设计了双杂交系统。 （4）构建过程：构建两个重组质粒：一个表达 BD，另一个表达 AD。如果在 BD 基因上再接上一个蛋白 X 基因，在 AD 基因上接上一个 Y 基因，将这两个质粒导入酵母菌中。这样，如果 X、Y 蛋白在酵母核内发生交互作用，则相当于将 GAL4 蛋白的 BD 和 AD 又重新连在一起，可以激活转录下游报告基因 GAL1-lacZ 的表达。通过测定 -半乳糖苷酶的活性来检测蛋白交互作用的发生。 （6）应用：检测蛋白与蛋白之间的相互作用
5、。 （2）5.简述乳糖操纵子如何通过正负调控机制进行基因表达调控的?（共分）答：（1）阻遏蛋白的负调控：当细胞内有诱导物时，诱导物结合阻遏蛋白，此刻聚合酶与启动子形成开放式启动子复合物转录乳糖操纵基因当无诱导物时，阻遏蛋白结合与启动子与蛋白质部分重叠不转录（2）CAP 正调控：当细胞内缺少葡萄糖时，ATP-CAMP 结合，CRP 生成 CAP 与 CAP 位点结合，增强 RNA 聚合酶转录活性。当有葡萄糖存在时 CAMP 分解多合成少，CAP 不与启动子上的 CAP位点结合，RNA 聚合酶不与操纵子区结合无法起始转录,结构基因表达下降。6.什么是 miRNA 以及它的特点及研究 miRNA 重
6、要意义。(12 分)miRNA 是指微 RNA，其长度通常为 21nt25 nt，由内源基因编码（如线虫体内发现的 lin-4 和 let-7，长度分别为 22 nt 和 21 nt），前体含有不完善的发夹结构，能够识别多个目标，通常与目标 mRNA 的 3-UTR 结合，从而阻止它们的翻译，但并不导致目标 mRNA 的水解。概念：是广泛存在于真核生物中的一类内源性非编码小分子 RNA，它是由约 1925 个核苷酸组成。它本身不具有开放阅读框架(ORF) 。 （2）特点与意义：（1）表达具有组织特异性和阶段特异性。即：在不同组织中表达有不同类型的 miRNA,在生物发育的不同阶段里有不同的 m
7、iRNA 表达。 （2）（2）miRNA 具有高度保守性，即各种 miRNA 都能在其他种系中找到同源体。 （2）（3）与靶 mRNA 3-UTR 结合，序列特异性的在转录后水平调控基因的翻译表达。一些偏大的 miRNA (27nt)可能参与了基因组的重组装。 （2）（4） miRNA 独有的特征：其 5端第一个碱基对 U 有强烈的倾向性，而对 G 却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏 U，一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏 C。 （2）（5） miRNA 执行一定的生物学功能：在生长发育、信号转导、免疫调节、细胞周期、细胞的分化、增殖和凋亡以及肿瘤发生等方面发挥着重要作用。（2）1
8、、RNA 干扰的发现和原理 RNA 干扰是指通过双链 RNA 使目的 mRNA 降解，从而特异性地抑制目的蛋白表达的现象。RNA 干扰是普遍存在于真菌、植物、果蝇等各类真核生物之中的现象，类似于一种古老的免疫机制。1990 年，Napoli 教授在研究矮牵牛花查尔酮基因时发现了基因共抑制现象（cosuppression）1。她在体外构建了控制矮牵牛花花色的基因查尔酮基因片段，连上花椰菜花叶病毒的 35S 启动子，连入农杆菌的 T-DNA 质粒，在矮牵牛花中过度表达。她原先预期，查尔酮的过度表达能加深牵牛花花色的紫色，但是结果却导致了矮牵牛花子代花色的褪色，内源性的查尔酮遭到沉默。Napoli
9、教授把这一现象称之为内源性基因共抑制现象。1998 年，Andrew J. Hamilton 教授研究了番茄 ACC 氧化酶基因的基因共抑制现象。他利用放射性标记法和放线菌酮处理法分析转录后 ACC 氧化酶基因的 mRNA和成熟 mRNA。实验结果表明，外源重组基因片段能成功转录，但是 mRNA 成功转录出后，因为某种原因发生了转录后基因沉默（post transcriptional gene silencing PTGS）2。因此，Andrew J. Hamilton 认为内源性基因共抑制现象属于转录后的基因沉默现象。1998 年，Fire 和 Mello 课题组接手了 Guo 教授研究的秀
10、丽新小杆线虫发育过程中的一个关键基因 par-13的课题。他们以秀丽新小杆线虫为模型，发现在Guo 的课题中，引发线虫 par-1 基因沉默的是小片段的双链 RNA4，而不是正义单链 RNA 或负义单链 RNA。他们之后又研究了秀丽新小杆线虫的 unc-22 基因，进一步阐述了双链 RNA 在基因沉默中的作用，并创造性地使用了“RNA 干扰”这个名词。他们的研究成果激起了其他科学家研究 RNA 干扰现象的浓厚兴趣，由于他们的发现揭示了分子生物学中一个全新的，具有普遍性的机制，Andrew Fire, Craig C. Mello 两位科学家因此在 2006 年获得诺贝尔奖2. RNA 干扰的原
11、理2.1 线虫中的 RNA 干扰模型Tabara 教授于 1999 年以秀丽新小杆线虫为模型，揭示了 RNA 干扰的原理5。线虫细胞上的跨膜蛋白 SID-1 引导细胞外的长链双链 RNA 进入细胞质，RNA 立即与细胞质内的 RDE-4，RDE-1 蛋白形成复合体。然后 DCR-1 与 DRH-1 蛋白与该复合体结合，DCR-1 蛋白将长链 RNA 切断，得到 RDE-1 结合的 siRNA（小干扰 RNA）复合物。RDE-1-si-RNA 复合物在解旋酶的作用下解链，RDE-1 蛋白脱去，RISC 酶与正义链和反义链中的一条链结合，RISC-单链 RNA 复合物在引导下与靶 mRNA 结合。
12、反义 RNA 与靶 mRNA 上同源的部分特异性结合，在 RISC 的作用下，靶 mRNA 链被切断，无法与核糖体结合，翻译成蛋白质，引起基因沉默。同时，以反义 RNA 为引物，以 mRNA 为模板，在 RdRP（RNA 依赖性 RNA 聚合酶）的作用下，生成新的 siRNA 反义链。这就是 siRNA 的级联放大的机制。RNA 干扰现象介导的 mRNA 降解特异性强，同时由于放大机制的存在微量 siRNA就能引起明显的 RNA 干扰现象。6线虫中的 RNA 干扰机制比较典型，但是在高等生物中，RNA 的机制又有细微差别。2.2 高等植物细胞中的 RNA 干扰机制植物细胞中在细胞核内产生的内源
13、性 miRNA（微小干扰 RNA）参与了植物的基因表达的调控。植物 miRNA 多数长 21 个碱基，具有保守性，它的产生，是由miRNA 前体长链 dsRNA 经 Dicer 酶家族（与 DCR-1 类似，常被称为 DCL1、DCL2等）切割产生。 以下机制为高等植物所特有7 干扰机制依赖于 Ago 蛋白家族，该家族有 10 个成员，它们在 siRNA 积累，DNA 甲基化作用中起着关键作用，在整个 RNA 干扰的转录后基因沉默（PTGS）机制中起调节作用 Dicer酶家族在高等植物中有特异性，共 4 个成员，称之为 DCL1DCL4 它们与 miRNA的成熟有关。同时，miRNA 的成熟需
14、要植物细胞特有的 HYL1 这种双链 RNA 结合蛋白的参与 植物中特有的 RDRs（RNA 依赖的 RNA 多聚酶） ，它的作用机制与昆虫，哺乳动物有明显差异2.3 哺乳动物的 RNA 干扰机制哺乳动物的 RNA 干扰机制与高等植物稍有不同，主要表现在以下几方面： 动物 miRNA 的长度多为 2224 个碱基，比植物长 动物 miRNA 的前体比植物miRNA 的前体短得多，后者的长度是前者的三倍。 动物 miRNA 由Drosha（与 Dicer 酶类似） 、RNase在细胞核、细胞质中分两步完成，而该步骤在植物细胞的细胞核中完成 动物 miRNA 在切断 mRNA 时，通常喜欢在 3非
15、翻译区域结合 哺乳动物如人类，小鼠等具有较发达的免疫系统，外源性大片段 dsRNA 会引起干扰素样反应，蛋白酶 R（PKR）被激活，有时还能激活寡聚腺苷合成酶（OAS）通路，使得细胞内蛋白质翻译停止，细胞死亡，该现象不出现在植物细胞中。2、真核与原核生物基因表达调控的区别第一种解答：调控的原因：原核生物基因表达调节的目的是为了更有效和更经济地对环境的变化做出反应，而多细胞真核生物基因表达调节的主要目的是细胞分化，它需要在不同的生长时期和不同的发育阶段具有不同的基因表达样式；调控的层次：原核生物基因表达调控主要集中在转录水平，但真核生物基因表达的转录后水平调节与其在转录水平上的调节各占“半壁江山
16、”，而某些调控层次是真核生物特有的，比如染色质水平、RNA 后加工水平和 mRNA 运输等；调控的手段：原核生物绝大多数的基因组织成操纵子，但真核生物一般无操纵子结构。第二种解答：原核生物的机体能在基因表达过程的任何阶段进行调控，如调控可在转录阶段、转录后加工阶段和翻译阶段进行。转录的调控主要发生在起始阶段，这样可避免浪费能量合成不必要的转录产物。通常不在转录延伸阶段进行调控，但可在终止阶段进行调控，终止可以防止越过终止子而进行下一个基因的转录。RNA 的初级转录产物本身是一个受调控的靶分子，转录物作为一个整体其有效性可以受到调控，例如，它的稳定性可以决定它是否保存下来用于翻译。此外，初级转录产物
