《携带β内啡肽基因的腺病毒载体的构建及其体外表达和体内转染治疗大鼠坐骨神经痛的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《携带β内啡肽基因的腺病毒载体的构建及其体外表达和体内转染治疗大鼠坐骨神经痛的实验研究（87页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第二军医大学 硕士学位论文 携带-内啡肽基因的腺病毒载体的构建及其体外表达和体内转 染治疗大鼠坐骨神经痛的实验研究 姓名：尤圣武 申请学位级别：硕士 专业：麻醉学 指导教师：俞卫锋;钱其军 20030501 第二军医大学缩略词表硕士学位论文 缩写 A d A d V A d G F P A d N E P b p B E P B S A C A R C C I C s C l D M E M D M S O D R G F B S G F P H P L C I T R k b L B r l l l n M O I N E P N M D A P B S P C 2 P C A 缩略词表 英
2、文全称 A d e n o v i r u s A d e n o v i r a lV e c t o r A d e n o v i r u sc a r r y i n gG F P g e n e A d e n o v i r u sc a r r y i n gN E P g e n e B a s eP a i r B e t a - e n d o r p h i n B o v i n eS e r u mA l b u m i n C o x s a c k i e a d e n o v i r u sr e c e p t o r C h r o n i cc o n
3、s t r i c ti n j u r y C e s i u mC h l o r i d e D u l b e c c o sM o d i f i e dE a g l eM e d i u m D i m e t h y lS u l f o x i d e D o r s a lr o o tg a n g l i a F e t a lB o v i n eS e r u m G r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n H i g h P e r f o r m a n c eL i q u i dC h r o m a t o
4、g r a p h y l a y e r e dT e r m i n e d R e p e a t s K i l o b a s e s L u r i a - B e l X a n i ( b r o t h ) M i n u t e M u l t i p l i c i t yo f I n f e c t i o n ( V i r u s C e l l ) p p - N G F - - b e t a - e n d o r p h i nf u s i o ng e n e N - m e t h y l - D a s p a r t a t e P h o s
5、p h a t eB u f f e r e dS a l i n e P r o t a s eP C 2 P a t i e n tc o n t r o la n a l g e s i a 中文全称 腺病毒 腺病毒载体 携带G F P 基因的腺病毒 携带N E P 基因的腺病毒 碱基对 1 3 内啡肽 小牛血清白蛋白 柯萨奇腺病毒受体 慢性捆扎损伤 氯化铯 D M E M 培养基 二甲基亚砜 后角背根神经元 胎牛血清 绿色荧光蛋白 高效液相色谱 反向末端重复序列 千碱基对 L B 培养基 分钟 感染复数 神经生长因子前导肽B 内 啡肽融合基因 N 甲基D 天门冬氨酸 磷酸盐缓冲液 蛋白
6、水解酶P C 2 病人自控镇痛 第= 军医大学缩略词袭 硕士学位论文 P C R P F U P O M C P P N G F 砒A R T p C R S e C T e l D 5 0 P o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n P l a q u eF o r m i n g U n i t P r o - o p i o m e l a n o c o r t i n P r e - p r o - n e r v eg r o w t h f a c t o r R a d i o i m m u n o a s s a y R e t
7、 r o t r a n s c r i p tP C R s e c o n d T i s s u eC u l t u r eI n f e c t i O U SD o s e5 0 多聚酶镶式反瘦 空斑形成单位 前阿疫索原 神经生长因子前导肽 放射免痰检测 逆转录聚合酶镳反应 秒 5 0 组织蜷莽感豢赛量 第意军医大学中文摘要礤士学位论文 携带内啡肽基因盼腺病毒载体的构建及其体辨 表达帮体内转染治疗大鼠坐嚣辩经痛的实验研究 【摘要】 研究背景及舅的： 慢性神经痛是一个世界性的难舔，它的发病机稠极其复杂。弱前的治疗手 段如药物治疗和交感神经切除术等，只能达到短期治疗目的，而且副作用大。
8、 土毯纪9 0 年代开始出现的瀑因治疗方法，农动物实验和溢徕前期实验中取褥了 一定的疗效。基因治疗可以避免l 临床用药的相关副作用如药物中毒或成瘾镎， 同辩治疗持续时间长，寿羽对己爱发生阿片类药穆辩受的韵耪仍然具有治疗效 果。但是基因治疗存在的最大问题怒载体的安全性和目的基因的疗效两个方厩， 雷懿在已有豹基因治疗系统中藤病毒疆箕安全往高、宿主臻胞范嚣广、离滚凄、 制备容易而得到最广泛的应用，已经有许多用于肿瘤治疗的临床实验报道。目 静鏊困方西嚣蓠骚究较多翡仍然爰鬻冀获豢蠢。参蠹簿歉蹩一辩重要静耱经 肽，在体内具有强效的镇痛作用。研究表明B 内啡肽对慢性神经痛治疗治疗作 用，僵是采羯蛋鑫稍裁貉臻
9、荠不可抒，困魏采瑶疼蹲获捧秀嚣豹基因胃g 有 助于慢性神经痛的治疗。但是9 内啡肽只幽下丘脑和腺垂体的神缀内分泌细胞 分泌，辨靥襻经元帮其链缭憝缺乏糖关静分泌逶鼹露关键黪。藏辩，神经系统 腺瘸霉基因转染面临着特殊的难题，载体大部分不能通过软膜细胞层感染神经 元，霾瑟，叛章孛经元为靶终蕤懿转潦效率鬣。礤究袭弱采瓣绥憨载体零鬯穿孔 技术转基因分泌B 。内啡肽对慢性神经痛都舆有治疗效果，但是这两种方法操作 复杂，转基瓣分泌不稳定。褥采用较长夔享枣经生长因子约蓊罢肽霹以键遴1 3 蠹 啡肽骚自在软膜细胞的表达和分泌，这种聚用腺病毒载体鬟统鞘内转基因分泌 豹t 3 瘪唾黢爨叁对炎蛙瘫懿逶敏其黉甥显懿接菝
10、效癍。毽楚这秘瘸毒系统在软 膜细胞内的表达效果以及是否合成成熟的B ，内啡肽，转基因分泌的蛋白对慢性 耱缀瘫是否其毒治疗效果，蕊喾液波鲍蛋臼浓度与镇痛效波是否舆毒相关键， 同时治疗的持续时间以及是否发生耐受，都需要进一步的研究。 我霞拨采用缨蘩爽重缀法梅建携豢小躐睾枣经生长因子懿导致譬1 3 内避 默融 合綦因的腺病毒，只要两步即可构建得到瘸毒重组子，比传统的构建方法艇为 簿单。馋强实验中进一步的礤究它在套静上皮细臌内的表达以及农大鼠慢性坐 骨神经痛模挺上的寝达情况和对慢性疼痛的治疗效果，目的在于观察这种病毒 基戮治疗系统对慢燃毒孛经瘸的治疗效果，弼时也程予为慢性神经璃的基因治疗 寻找更好治疗
11、系统，为将来开发更为长期离散的治疗系统掇供技术和理论蕊础。 第二军医大学中文摘要 硕士学位论文 方法： 1 利用逆转录P C R 法和人工合成法构建融合基因神经生长因子前导肽B 内啡 肽融合基因，构建到p T r a e k C M V 载体上，经测序正确后命名为p T C N E 。 2 利用A d E a s y T M 系统构建了非增殖型腺病毒载体，经P C R 鉴定正确后，命名 为A d v N E P 。通过扩增和纯化得到高滴度的重组病毒用于体外和体内实验。 3 在体外实验中，通过逆转录P C R 法观察融合基因m R N A 的转录：用荧光显 色观察病毒对细胞的感染能力；放射免疫法
12、测定M O I = 1 0 的病毒转染2 9 3 细 胞、A 4 3 1 细胞、N I H 3 T 3 细胞3 天时培养基内的B 内啡肽含量；放射免疫 法测定1 、3 、7 天时培养基内的B 一内啡肽含量以及一周内的表达趋势；免 疫组化定性细胞内内啡肽成熟肽的翻译。 4 通过蛛网膜下腔注射重组病毒观察大鼠坐骨神经捆扎术( C C I ) 模型热痛闽 的变化及其时程，以及其效果与鞘内注射吗啡的对比；纳络酮拮抗实验观察 这种镇痛效应能否逆转；放射免疫法测定脑脊液内1 3 一内啡肽含量和表达趋 势以及其与热痛阈变化的相关关系；脊髓组织冰冻切片荧光显微镜观察和石 蜡切片免疫组化实验观察病毒转染部位。
13、5 统计分析：A N O V Ao n e w a y 检验和随机两样本t 检验。所有样本分布情况 用均数标准差表示。 体外实验结果： 1 感染细胞能力：荧光显微镜下动态观察的结果表明，A d v - N E P 能够感染A 4 3 1 细胞但不增殖。 2 转录水平分析：用融合基因上下游引物能够扩增到融合基因的e D N A ，证实 融合基因m R N A 的高效转录。 3 免疫组化定性：细胞涂片免疫组化实验可观察到感染细胞内含有大量的B 。 内啡肽分泌性囊泡，表明病毒A d v N E P 能够在A 4 3 1 细胞内合成大量的B 内啡肽成熟肽。 4 表达效果测定：放射免疫法测定观察到病毒转
14、染2 9 3 细胞、A 4 3 1 细胞、N I H 3 T 3 细胞3 天时培养基内的含有高浓度的t 3 内啡肽，其浓度是对照组的1 0 0 倍 左右。在A 4 3 1 细胞培养基内可观察到一周的高表达，随时间浓度逐渐增高， 到第七天时最高。 体内实验结果： 1 热痛闽变化：从治疗第一天开始，病毒治疗组大鼠的热痛阈就明显高于A d G F P 组和生理盐水对照组( P 0 0 5 ) ，持续 时间长达4 周，但未见非手术侧足底热痛阈的变化( P 0 0 5 ) 。 2 纳络酮拮抗实验：腹腔注射纳络酮能够有效逆转A d v - N E P 引起的热痛闽的 J - 第二军医大学中文摘要硕士学位论
15、文 升高f P o 0 5 ) 。实验结果提示腹腔注射纳络酮能够有效逆转A d - N E P 的 镇痛效应，证明A d - N E P 的镇痛效应是B 内啡肽作用于脊髓后角阿片受体， 第二军医大学第三部分硕士学位论文 抑制伤害性信号的上传产生的。 5 荧光显微镜观察结果 冰冻切片荧光显微镜下观察显示，A d - N E P 病毒主要感染脊髓外周的软膜细 胞，少量病毒进入后角感染表层神经元，而白质内的感染量极低。 图3 5 ：A d - N 口P 病毒感染第三天冰冻切片荧光照片A I 荧光照片( 1 0 1 0 ) B ：黄色f 嗍片( 1 0 1 0 ) 6 石蜡切片免疫组化实验结果 所有切
16、片都为L 6 L 7 节段，固定、石蜡包埋、切片、脱腊后用小鼠抗人1 3 一 内啡肽单克隆抗体作免疫组化实验，苏木素染色后封片照相。 图3 6 ，大鼠鞘内注射A d G 开三天后脊奠石培切片免疫组化结果( 1 0 X 2 0 ) 第二军医大学第三部分硕士学位论文 图3 7 ：C C I 大鼠鞘内注射A d - N E P 病毒天后脊髓石蜡切片免疫组化结果( 1 0 X 2 0 ) 图3 8 ：C C I 大鼠鞘内注射A d - N E P 病毒三天后脊髓石蜡切片免疫组化结果( 1 0 X 2 0 ) 5 9 第二军医大学 第三部分 硕士学位论文 图3 9 ：C C I 大鼠鞘内注射A d - N E P 病毒七天后脊髓石蜡切片免疫组化结果( 1 0 X 2 0 ) 组化实验显示A d N E D 病毒主要感染脊髓外围的软膜细胞，后角区可见少量 细胞表达人B 一内啡肽蛋白，因为特异抗体并不与大鼠的内啡肽结合，所以 这些B 内啡
