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1、南方医科大学2 0 0 8 级硕士学位论文 携P 一选择素单抗靶向微泡结合对比超声评价 动脉早期血栓效果的研究 E v a l u a t i o no fa c u t ea r t e r i a lt h r o mb u sw i t hm i c r o b u D D i e s 一 一 一 oooo 1 t a r g e t e dt oP s e l e c t i na n dc o n t r a s te n h a n c e du l t r a s o u n d ： a ne x p e r i m e n t a ls t u d y 课题来源：国家8 6 3
2、 计划项目( 2 0 0 6 A A 0 2 2 4 7 8 ) 、国家自然科学基金( 3 0 3 7 0 5 8 9 ) 专业名称 学位申请人 指导教师 答辩委员会主席 答辩委员会成员 内科学( 心血管病) 黄瑞珠 宾建平教授 刘伊丽教授 程继东教授 谢志泉教授 许兆忠教授 张稳柱教授 论文评阅人何亚乐教授 黄晓波教授 20 11 年5 月25 日 广州 硕士学位论文 7 1 8 4 9 9 75 8 4Y 1 携P 一选择素单抗靶向微泡结合对比超声 评价动脉早期血栓效果的研究 硕士研究生：黄瑞珠 指导教师：宾建平教授 摘要 背景和目的： 血栓性疾病包括动、静脉血栓性疾病，是临床常见的急危重
3、症，具有高发 性、高致残性和高致死性等特点，严重危害人类生命健康。目前血栓性疾病诊 断主要依赖于临床表现和多普勒超声、螺旋C T 血管造影、 V I R 血管造影等检查。 由于早期新鲜血栓的超声回声与血液回声基本相似，多普勒超声对新鲜血栓的 检出率受限；血管造影等非特异性成像检查只有在机体发生明显的病理或解剖 结构改变时才能检出异常，对早期急性附壁血栓仍缺乏特异性和敏感性；加之 患者早期症状较为隐匿，临床不易察觉，因而在血栓性疾病得到确诊时，受累 器官或组织往往已发生不可逆的器质性损伤，进而错过最佳治疗时期。临床迫 切需要一种无创、敏感且具有高特异性的技术检测手段对血栓性疾病进行早期、 快速、
4、准确、及时的诊断，从而能够早期、及时地对动静脉血栓性疾病进行治 疗，以降低患者的死亡率及并发症的发生率。 近年来，出现了- - f - j 新兴的靶向超声分子成像技术：它通过对普通超声微 泡表面进行特殊处理，将靶向于病变组织特定分子的特异配体( 抗体、肽等) 连接于普通超声微泡外壳，构建成靶向超声微泡，使靶向微泡经静脉注入后靶 向粘附、聚集并较长时间滞留于靶组织或器官中，再结合对比超声检查，产生 分子水平的特异性的“主动性靶向超声分子成像”。靶向超声分子成像可在机体 摘要 未发生明显改变时从分子水平无创性早期评价各种组织和器官的病理改变，有 高度的特异性和敏感性，有实现对早期血栓诊断与治疗的潜
5、能。目前，国际上 已有一些实验室应用精一甘一天冬氨酸( R G D ) 多肽为配体的靶向血小板糖蛋白 l i b I l i a ( G P I I b I I I a ) 的超声微泡成功实现在动物深静脉和心房心耳中血栓的超 声分子成像，但对于动脉血栓的超声分子成像研究则鲜有报道。究其原因，除 了因为R G D 多肽微泡难以抵抗动脉血流高剪切应力的冲刷之外，更重要的原因 可能是因为在血小板聚集后期G P I I b I I I a F i b r i n o g e n ( 纤维素) 复合物逐渐陷入或 移入血小板小管系统，在血小板表面的G P I I b I I I a 受体明显减少，使得R
6、G D 多肽 微泡在动脉血流环境下难以与其靶标G P I I b I I I a 结合。因此要实现动脉血栓的超 声分子成像，我们需要在动脉血栓上寻求新的靶点以解决问题。 动脉血栓主要为血小板血栓，在活化血小板上另外存在高度密集的P 选择素 为我们提供了另一选择。研究显示，血小板活化后持续高表达P 选择素，在一个 活化的血小板膜表面上约有高达1 00 0 0 个P 选择素分子表达，密度约为3 5 0 个 g m 2 ，是公认的血小板活化的标志。在急性冠脉综合征、冠脉支架术后、中风 及外周动脉疾病等动脉血栓性疾病中，P 选择素在血小板上的表达均有异常增 高。M e r t e n 等研究发现在血小
7、板聚集过程中，当G P I I b I I I a - F i b r i n o g e n 复合物逐渐 陷入或移入小管系统后，血小板表面仅留下大量的P 选择素作为唯一的连接分 子，它通过与相邻血小板表面的硫脂类受体相结合，使血小板连接形成大而稳 定的血小板血栓。P 选择素作为血小板活化后1 5m i n 在血小板聚集的连接区域唯 一存在的糖蛋白，在活化血小板上高度密集并持久表达，提示我们可选择P 选择 素作为动脉血栓的靶标。 因此，本研究在普通脂质微泡的基础上，通过“抗生物素蛋白生物素复合 体”的化学桥接作用将小鼠P 选择素单克隆抗体连接于脂质微泡外壳，构建了携 带P 选择素单抗的血栓靶向
8、超声微泡( M B p ) ，创新性将其应用于动脉血栓的 活体超声分子成像研究。本研究建立自制的琼脂糖流动腔模型( 模拟体内高剪 切应力血流环境) 和小鼠腹主动脉早期血栓模型，应用M B p 与对比超声( C E U ) 检查相结合，分别对体外制备的血栓以及小鼠腹主动脉早期血栓进行靶向超声 硕士学位论文 分子成像，评价其效果，旨在探索可实现动脉早期血栓超声分子成像的有效超 声分子探针。 材料和方法： 1 超声微泡的制备及理化性质鉴定 各种脂质材料按一定比例7 5 水浴溶解于适量蒸馏水中，同时通全氟丙烷 ( C 3 F 8 ) 气体，超声振荡至形成乳白色液体，静置弃下清液并加入等量蒸馏水以 去除
9、未结合脂质( 重复4 次) 。按一定比例加入抗生蛋白链菌素，静置弃下清液 2 次，按一定比例加入生物素化抗小鼠P 一选择素单克隆抗体，静置过夜后弃下清 液2 次。同样方法将同型I g G 抗体连接在生物素化脂质微泡表面，得到同型对照 微泡( M B ) 。将微泡置于4 冰箱保存备用。在普通光学显微镜下动态观察微泡 的稳定性，采用库尔特计数仪测量M B p 和M B 的粒径分布及浓度。 2 采用平行板流动腔技术体外评价M B p 与小鼠P 选择素F c 段( R e c o m b i n a n t M o u s eP S e l e c t i n F cC h i m e r a ，P
10、S F c ) 的靶向黏附效能。 2 1 结合实验：将2 0 0 山的P S F 。( 1 0 0 0n g m 1 ) 包被于平行板流动腔的聚苯 乙烯培养皿上，等量的M B p 和M B ( 5 x 1 0 6 m 1 ) 分别经微量注射泵以4d y n c m 2 的高剪切应力流速通过平行板流动腔( n - 3 ) ，自显微镜下观察到有微泡出现后 开始连续录像6m i n ，动态观察每分钟微泡与包被于聚苯乙烯培养皿上的P S F 。 的靶向结合情况；以“O n g m lP S F 。包被( 空白组) 为对照。 2 2 解离实验：平行板流动腔以2 0 0 山的P S F 。( 1 0 0
11、0 n g m 1 ) 包被，流动 腔内分别注入5 x 1 0 6 m lM B p 或M B0 2m l 后静置5m i n ，先以P B S 液( 极低剪 切应力O 2d y n c m 2 条件下) 冲洗掉静止但未结合的微泡，待镜下无游离的微泡 后，每3 0S 逐渐增加1 次剪切应力，直至微泡完全解离。2 0 倍物镜在固定的视 野下全程录像、拍照。 3 应用琼脂糖流动腔模型体外评价M B p 靶向血栓效能 自制琼脂糖流动腔模型，将体外制备的新鲜血栓分别悬挂固定在琼脂糖流 动腔模型中，将等量的M B p 和同型对照微泡( M B ) 随机先后注入自制琼脂糖流 动腔模型内，与血栓孵育3 0m
12、 i n 后，P B S 液1 5e m s 流速不问断冲洗血栓，分 I I I 摘要 别在冲洗血栓2 、4 、6 ，8 、1 0m i n 时行对比超声检查并测量血栓声强度( V I ) 值。根据注入超声微泡的不同分为M B p 组和l v I B 组。 4 小鼠腹主动脉早期血栓模型的制备及C E U 检查 实验小鼠常规麻醉后，开腹后采用血管内膜损伤法制成小鼠腹主动脉不完 全栓塞的早期急性血栓模型。3h 后已制备腹主动脉血栓模型的小鼠随机先后注 入等量M B p 和M B 后行C E U 检查，并根据注入超声微泡的不同分为M B p 组和 M B 组。行C E U 时，保持探头位置和超声各项
13、参数在整个实验过程中不变( 参数 设置同体外实验) 。每只小鼠采用微量加样器经尾静脉随机先后注射M B 和M B p 的数量约为1 0 x 1 0 6 个( 间隔3 0r a i n ) 。在注入微泡6m i n 后行对比超声，获取第 一帧图像后给予高机械指数的连续超声发射2 3S 以破坏微泡，继续存储本底图 像2 3 帧，全部声学造影图像存于C D 盘，以备脱机分析。第一帧图像声强度代 表微泡在观察区的总浓度，包括粘附在血栓上的粘附微泡和血池中的循环微泡； 微泡破坏后存储图像上的值则代表血池中循环微泡的浓度；前者减去后者则 得到粘附在血栓中微泡的浓度。 5C E U 图像分析 取图结束后，应
14、用M C E 分析软件对所得图像进行分析，测量P B S 液冲洗2 、 4 、6 、8 、1 0m i n 血栓的V I 值和小鼠腹主动脉血栓的V I 值，采用彩色编码技术 制作血栓显影的彩色编码图像，红色、橙色和蓝色依次代表血栓显影的强度由 强到弱。 6 病理学检测 图像采集完成后，取体外血栓及小鼠腹主动脉迅速做冷冻切片，行H E 染色 及免疫组化检查。 7 统计学分析 使用S P S S1 3 0 软件进行统计学分析，所有数据均以孤表示，差异性检验 水准为a = 0 0 5 ( 双侧) 。 结果： 1 超声微泡制备情况 I V 硕士学位论文 显微镜下观察M B 和M B p 均为透亮微气泡
15、，大小形态一致。采用库尔特计数 仪测得M B 的平均粒径为2 4 0 3 岬，浓度约( 5 5 6 8 ) 1 0 8 个m l ；M B p 的平 均粒径为2 6 - 4 - 0 4 岬，浓度约为( 2 8 4 2 ) X1 0 8 个m l 。 2 采用平行板流动腔技术体外评价微泡与小鼠P 选择素F c 段( P S F c ) 的靶 向黏附效能 2 1 平行板流动腔结合实验显示，在模拟动脉生理血流条件的高剪切应力 ( 4 0d y n c m 2 ) “ F M B p 可与包被于平行板流动腔的P S F 。有效结合，6m i n 后每个视 野中仍可见较多粘附的靶向微泡，为( 4 3 0
16、 0 4 0 0 ) 个视野，显示了很好的主 动性靶向黏附效能，在空白对照组d e M a p 几乎不能与P S F c 结合；而M B 不论在空 白对照组还是P S F 。包被组均不能与平行板流动腔结合。 2 2 平行板流动腔解离实验显示，p 能够抵抗P B S 液一定剪切应力的冲 刷，M B p 半数解离时剪切应力达到( 2 8 1 3 4 - 4 2 4 ) d y n c m 2 ，微泡完全解离时剪 切应力高达( 9 6 5 14 - 2 7 1 ) d y n e m 2 ；而M B 半数解离时及完全解离时剪切应力仅 有( 7 1 8 1 4 4d y n c m 2 ，P = 0 0 0 1V SM B p ) 和( 2 5 5 2 2 2 1d y 肌m 2 ，尸= 0 0 0 0 V SM B p ) 。 3 体外血栓C E U 显影图像及V I 值分析 体外血栓与M
