AD自噬改动标红

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1、二苯乙烯苷通过抑制的Beclin-1、LC3-表达改善APP695V717I转基因鼠的行为学障碍罗红波,石向群, 郭建魁,张志强,汪泳,李芸,尹榕（兰州军区兰州总医院神经内科,甘肃省 兰州市 730050）【摘要】目的 探讨在APP695V717I转基因鼠模型中，二苯乙烯苷(TSG)对大鼠行为学的保护作用及其对自噬分子Beclin-1、LC3-的表达影响。 方法 选取10月龄APP695V717I转基因小鼠40只，随机数字表法分为药物组组、模型组，各20只, 药物组给予TSG灌胃 1个月, 同背景同月龄C57BL/6J小鼠为正常对照组。行为学检测应用Morris水迷宫实验和Y电迷宫实验。反转录

2、聚合酶链反应及免疫印迹法检测海马神经元自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-的mRNA及蛋白表达变化。结果 在模型组中，大鼠Y电迷宫躲避所需的电刺激次数增加，Morris 水迷宫测试中潜伏期延长, 游泳路程增加及穿越平台次数减少；Beclin-1和LC3-的mRNA及蛋白的表达增高，与对照组比较有统计学意义(P0.05)；TSG药物干预后，大鼠躲避所需的电刺激次数减少，潜伏期缩短, 游泳路程缩短，穿越平台次数增加；Beclin-1和LC3-的mRNA及蛋白的表达较模型组下降(P0.05)，差异有统计学意义。结论 二苯乙烯苷可通过下调自嗜通路中Beclin-1和LC3-的表达，以抵抗A的神经毒性

3、作用对内质网功能的损害，从而改善大鼠的学习记忆、空间定向等行为学表现。【关键词】A PP转基因小鼠；自噬；二苯乙烯苷；行为学阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)是一种神经系统变性疾病，其主要的病理学特征之一是脑组织中出现大量老年斑1。老年斑主要由-淀粉样蛋白(-amyloid，A)形成，A是通过淀粉样样前体蛋白（APP）的异常剪切、折叠后所形成，在细胞内，对这种异常折叠的蛋白质，细胞可通过泛素蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)和自噬溶酶体途径来调控蛋白、细胞器的降解，从而保证蛋白质的正常工作，维持细胞功能的正常运行。有学者早期

4、研究发现AD患者在病理上表现为大量囊泡的堆积，但这种表现的机制及其在AD发病机制中的作用却没有得到明确的阐述；2006年，有学者建立自噬途径的重要蛋白Apg5/Apg7基因敲除的大鼠模型，发现该模型表现出神经变性疾病的一些表型，使得自噬途径在神经变性疾病得到了关注和重视2-3。本实验采用APP695V717I转基因AD动物模型观察大鼠海马神经元自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-的表达情况并探讨其意义。 AD患者的学习记忆及工作能力的逐渐丧失给家庭及社会带来沉重的负担，但目前其治疗尚无十分有效方法与药物 。研究显示何首乌的主要有效成分之一（2，3，5，4-四羟基二苯乙烯-2-0-D葡萄糖苷(

5、2，3，5，4-tetrahydroxy-stilbene-2-glycoside，二苯乙烯苷，TSG)能减少-淀粉样肽诱导的老年斑沉积，改善痴呆模型大鼠学习记忆能力，降低淀粉样前体蛋白(APP)的表达水平 。我们通过观察APP695V717I转基因鼠的行为学表现及自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-在海马的表达情况并探讨其意义，进一步揭示AD新的发病机制，以及何首乌提取物二苯乙烯苷治疗AD的主要作用机制及药物靶点。材料和方法一、材料1.实验动物分组及干预：10月龄APP695V717I转基因小鼠40只，雌雄各半(许可证号01-3001)，及20只年龄匹配的同背景C57BL/6J小鼠，雌雄各

6、半(作为正常对照)，均购自中国医学科学院实验动物研究中心。转基因小鼠随机数字表法分为TSG组、模型组，各20只。药物组给予TSG灌胃 1个月，每天1次，灌胃量按5 ml/kg计算。正常对照组给予生理盐水灌胃。2.主要试剂和药物：Beclin-1和LC3-一抗购于Stressgen公司；引物自行设计，由上海华大基因有限公司合成；Trizol、Taq酶、逆转录酶购自MBI公司。二苯乙烯苷为从何首乌中提取分离的干粉，含量为68%（湖南中医药研究所提供)，实验时用水溶解为100 mg/kg的浓缩液。二、方法 删掉“大鼠模型的建立、取材及干预”1.行为学检测：(1)Y电迷宫电击实验：电击次数表示其学习记

7、忆的获得能力，记录每只大鼠学会逃避电刺激次数，以30次为最大值计数。（2）Morris水迷宫定位航行实验(PNT )：每天08 :00-11:00之间对每只大鼠进行训练, 不选平台所在象限作为入水点, 按顺时针方向把大鼠面向池壁放入水中, 检测大鼠隐匿平台潜伏期。如果在规定的最长时间120s 内未到达平台, 则由实验者将其引至平台, 逃避潜伏期记为120s, 大鼠在平台休息20s后进行下一次测试。观察并记录动物找到并爬上平台的潜伏期、游泳路程及游泳轨迹。3 d 训练结束后将大鼠按组别进行造模。于制模后21 d进行PNT。（3）Morris水迷宫空间探索试验(SPT)：各组大鼠最后一次PNT后撤

8、除平台, 将大鼠从最后1次入水点面向池壁放入水中, 使大鼠在水迷宫中连续游泳，记录大鼠120 s内穿越原平台平面的次数。2超微结构检测：分离海马组织后，磷酸盐缓冲夜（PBS）洗涤2次，4%戊二醛固定，冷却后切块，2%锇酸固定，梯度丙酮脱水，浸泡，包埋，醋酸双氧铀-柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察。3. 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测mRNA表达：依据Medline基因文库自行设计引物，目的基因Beclin-1 (162 bp)，上游引物：5- CCCTACAGGATGGATGTGGAGAAAG-3,下游引物：5- ATTGTGAGGACACCCAAGCAAGACC-3; 目的基因LC3-(

9、136 bp)，上游引物：5- ACCAAGCCTTCTTCCTCC-3, 下游引物：5- TGTCCCGAATGTCTCCTG3-3; 内参照-actin (100 bp)，上游引物：5-CGTTGACATCCGTAAAGACCTCTA-3， 下游引物：5-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3。产物经琼脂糖凝胶电泳，于紫外投射灯下观察结果并拍照。4.免疫印迹法(Western blot) 测蛋白表达：密度梯度离心法提取蛋白，将海马组织转移到匀浆器中，加裂解液匀浆，离心10 min（2400 r/min，半径13.5cm），取上清，继续离心15 min（转速12000 r/m

10、in，半径13.5cm），取上清，再离心30 min（15 000 r/min，半径13.5cm）, 加入裂解液和蛋白酶抑制剂，用二奎琳甲酸（BCA）蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度；样品与等体积的上样缓冲液混匀，煮沸变性，用10十二烷基硫酸钠聚-丙烯酰胺凝胶电泳（SDS- PAGE）分离，转移蛋白至硝酸纤维素膜，5脱脂奶粉封闭，与一抗孵育，加入辣根过氧化物酶标记二抗孵育，ECL试剂盒进行化学发光检测，JS-300凝胶图像仪扫描分析处理。三、统计学方法数据用SPSS12.0软件处理。计量资料用表示，两组间比较用t检验，多组独立样本比较用方差分析。结 果删掉“模型组大鼠脑组织切片染色结果”一、 Y电

11、迷宫检测与对照组比较，模型组躲避电刺激数明显增加( t =10.0884，P 0.01)，药物组躲避电刺激数增加( t =2.7781，P 0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，经TSG干预，药物组学会躲避所需的电刺激显著减少( t =11.1755，P 0.01)，差异有统计学意义（表1）。二、Morris水迷宫检测与对照组相比，模型组和药物组小鼠的Morris 水迷宫测试游泳潜伏期( t =14.4648，P 0.01)及路程均增加( t =5.6550，P 0.01) , 穿越平台次数下降明显( t =15.5895，P 0.01) ，差别随时间的延长而加大；与模型组比较，药物组的

12、潜伏期缩短( t =5.5023，P 0.01) ) , 游泳路程缩短( t =2.2341，P 0.05) ,穿越平台次数增加(t =4.8163，P 0.01)，差异具有统计学意义。见表1。表1 大鼠水迷宫行为学比较比较（）组别n潜伏期测试(秒)路程测试(米)穿越平台测试(次)对照组2017.031.233.961.0518.134.15模型组2032.154.51 a 8.303.02 a3.091.18 a药物组20 25.263.76 a b 6.083.26 a c 4.821.09 a c注：与对照组比较：a P0.05；与模型组比较：cP0.05三、大鼠海马CA1区电镜下自噬现

13、象对照组：神经细胞胞膜完整，胞浆基质电子密度均匀，胞浆内线粒体结构清晰可见，细胞质内线粒体及粗面内质网丰富，结构大致正常，线粒体嵴清楚、完整，核圆、核膜完整清晰，高尔基体无改变。模型组：胞浆内线粒体结构欠清楚，嵴消失，少数呈空泡样变，粗面内质网结构欠清晰，部分扩张，核膜较模糊不清，高尔基体大致正常，见图2；胞内可见大量自嗜泡形成，见图3。药物组：胞浆内线粒体结构尚清楚，少数可见嵴消失，空泡样变很少见，粗面内质网结构尚清晰，少数见轻度扩张，偶见个别胞浆水肿，核膜尚完整，高尔基体正常，见图4。 图2 电镜6000倍 图3 电镜6000 倍 图4 电镜6000倍 四、自噬相关蛋白Beclin-1、L

14、C3-的mRNA及蛋白表达如图5/6/7所示，将RT-PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳并采用蛋白质印迹方法分析，可见模型组的Beclin-1、LC3-mRNA与其蛋白的表达趋势一致，与对照组比较，差异有统计学意义(P=0.000.05)；TSG组在Beclin-1、LC3-蛋白表达明显降低，与模型组比较有显著性差异(P=0.000.05)，排除手术因素干扰。见图8。表2大鼠Beclin-1、LC3- 的mRNA及蛋白相对表达(,%)组别 例数 mRNA的相对表达 蛋白的相对表达（%）Beclin-1 LC3-Beclin-1 LC3-对照组 200.250.01 0.230.03 0.200.01 0.260.02模型组 200.580.01 a 0.420.01 a0.630.01 a 0.520.01a药物组 200.410.02 a b 0.340.01 a b 0.490.02 a b 0.360.02 a b注：与对照组比较：aP0.05；与模型组比较： b P0.05；Beclin-1-actinLC3-actin A B C D A B C D 图5: Beclin-1/-actin的mRNA表达图 6: LC3-/-actin的mRNA表达A:对照组 B:药物组 C:模型组 A:对照组 B:药物组 C:模型组 Bec