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1、3.3 固定化酶促反应动力学 一、固定化酶催化的动力学特征一、固定化酶催化的动力学特征 1 影响固定化酶动力学的因素影响固定化酶动力学的因素 2 固定化酶反应动力学固定化酶反应动力学 二、固定化酶促反应中的过程分析二、固定化酶促反应中的过程分析 1 外扩散限制对酶催化反应速率的限制外扩散限制对酶催化反应速率的限制 2 内扩散限制效应内扩散限制效应 ?酶的固定化，不仅使酶的活性发生了变 化，而且由于固定化酶的引入，反应体系 变为多相体系，例如液液-固体系固体系、气气-液液-固 体系 固 体系等。因此在研究固定化酶催化反应动 力学时，不仅要考虑酶催化反应的本征动 力学规律，更要研究反应物的质量传递
2、规 律，研究物质的质量传递对酶催化反应过 程的影响。建立起同时包括物质传质速率 和催化反应速率的动力学方程；这种方程 一般称为宏观动力学宏观动力学方程。它是设计固定 化酶催化反应器和确定其操作条件的理论 基础。 ?当固定化酶与主体溶液接触时，总的传质 将由下列三个过程所组成 1)底物S从主体溶液中通过界膜传递到固定 化酶颗粒外表面；（外扩散外扩散） 2)底物S再传递到颗粒内部，在酶活性部位 进行催化反面转化为产物P；（内扩散和 酶促反应 内扩散和 酶促反应） 3)产物P沿着上述相反传送路线，从颗粒内 部渗透过界膜传递到主体溶液中。（内扩 散和外扩散过程 内扩 散和外扩散过程） 一、固定化酶促反
3、应动力学基础 1.影响固定化酶促反应的主要因素 （1）空间效应 （2）分配效应 （3）扩散效应 （1）空间效应 ?酶的活性部位和变构部位的性质取决于酶 分子的三维空间结构。酶在固定化过程中， 由于存在着酶和载体的相互作用，从而引 起了酶的活性部位发生某种扭曲变形，改 变了酶活性部位的三维结构，减弱了酶与 底物的结合能力，此种现象称为构象效应构象效应。 ?载体的存在又可产生位阻效应位阻效应。因为载体 的存在使酶分子的活性基团不易与底物相 接触，从而对酶的活性部位造成空间障碍， 使酶的活性下降。选择合适的载体和固定 化方法，可消除这种不利因素的影响。 （2）微环境效应分配效应 ?由于载体和底物的疏
4、 水性、亲水性以及静 电作用，经常引起微 环境与大环境之间不 同的性质，而形成底 物和各种效应物的不 均匀分布，这种现象 称为分配效应。 （3）扩散效应 ?固定化酶对底物进行催化反应时，底物 必须从主体溶液传递到固定化酶内部的催 化活性中心处，反应得到的产物又必须从 酶的催化活性中心传递到主体溶液中。这 种物质的传递过程包括分子扩散和对流扩 散。这种扩散过程的速率在某些情况下可 能会对反应速率产生限制作用，特别是由 于生物物质在液体中的扩散速率相当缓慢， 而酶的催化活性又很高时，这种扩散限制 效应会相当明显。 ?扩散限制效应可分为外扩散限制效应和 内扩散限制效应。 ?前者是底物从大环境主体溶液
5、中向固定 化酶表面传递过程的一种扩散限制效应。 它发生在固定化酶界面周围的处于停滞 状态的液膜层。由于外扩散阻力，底物 将在固定化酶的周围形成浓度梯度。扩 散阻力受固定化酶界面周围溶液的相对 速度的影响。因而外扩散阻力随着搅拌 速度的增加而减少。 ?内扩散阻力发生在多孔性固定化酶载体的 内部，它是底物传递到固定化酶内部的酶 部位时的一种扩散限制效应。内扩散限制 效应往往与酶催化的化学反应同时进行。 由于微环境内的化学反应造成底物的消耗 和产物的积累，形成浓度的不均匀性。而 在微环境内底物的消耗和产物的积累程度， 也常和这些物质的分子量大小有关。 从图中可以看出， 由于扩散限制效应 的存在，底物
6、浓度 从液相主体到固定 化酶外表面，再到 内表面是依次降低， 向产物浓度分布则 与此相反。 ?在上述讨论中，空间效应空间效应难以定量描述， 并且它与固定化的方法、载体的结构及性 质、底物分子大小和形状等因素有关。空 间效应的影响一般通过校正动力学参数 Vmax和Km来体现的。 2、固定化酶反应动力学 本征动力学本征动力学 ?分配效应分配效应造成的结果是使微现环境与宏观 环境之间的底物浓度出现了差别，因而影 响了酶催化的反应速率。如果在上述本征 动力学的基础上，仅仅考虑由于这种分配 效应而造成的浓度差异对动力学产生的影 响，所建立的动力学称为固有动力学固有动力学，对 该种动力学比较简单的处理方法
7、是：动力 学方程仍然服从M-M方程形式，仅对动力 学参数予以修正。 ?不论分配效应是否存在，固定化酶受到扩 散限制 扩 散限制时所观察到的速率统称为有效反应 速率，或称为宏观反应速率。据此所建立 的动力学方程称为宏观动力学方程宏观动力学方程，或称 为有效动力学方程。 ?由于生化物质在溶液内和固定化酶微孔内 的扩散速率是比较慢的，因而扩散阻力扩散阻力是 影响固定化酶催化活力的主要因素主要因素。并且 所建立的宏观动力学方程也不完全服从 MM方程形式。 ?从上述讨论可以看出，对固定化酶催化 反应动力学，不仅要考虑固定化酶本身的 活性变化，而且还要考虑到底物等物质的 传质速率的影响，而传质速率又与底物
8、等 物质的性质和操作条件以及载体的性质等 因素有关。 ?因此对这样一个实为非均相(液固)体系 所建立的宏观动力学方程不仅包括酶的催 化反应速率，而且还包括了传质速率。这 是固定化酶催化反应过程动力学的最主要 特征 最主要 特征。 二、固定化酶促反应中的过程分析 ?固定化酶促反应过程中，需考虑扩散传质 与催化反应的相互影响，注意外部与内部 扩散的不同传质方式。 ?内部扩散与催化反应有时是同时进行的， 两者相互影响。外扩散通常先于反应。应 区别对待。 为集中研究为集中研究外扩散限制效应外扩散限制效应，常选择液体不能渗透的无 电活性的固定化酶膜或固定化酶颗粒作为研究的模型。 ，常选择液体不能渗透的无
9、 电活性的固定化酶膜或固定化酶颗粒作为研究的模型。 此时，固定化酶与反应物系相接触，该反应过程包括三步：此时，固定化酶与反应物系相接触，该反应过程包括三步： 底物从液相主体扩散到达固定化酶的外表面；底物从液相主体扩散到达固定化酶的外表面； 底物在固定化酶的外表面上进行反应；底物在固定化酶的外表面上进行反应； 产物从酶外表面扩散进入液相主体。产物从酶外表面扩散进入液相主体。 其中，其中，(1)(3)为单纯的传质过程，为单纯的传质过程，(2)为催化反应过程。并且认为 这三步是串联过程，其中任一过程发生变化，都影响整个过程。 为催化反应过程。并且认为 这三步是串联过程，其中任一过程发生变化，都影响整
10、个过程。 1 外扩散速率对酶催化反应速率的限制外扩散速率对酶催化反应速率的限制 假定对一非带电的固定化酶，其外表面上的反应速率符合假定对一非带电的固定化酶，其外表面上的反应速率符合M-M方程，即：方程，即： 有效速率有效速率 1 外扩散速率对酶催化反应速率的限制外扩散速率对酶催化反应速率的限制 底物由液相主体扩散到固定化酶外表面的速率应表示为：底物由液相主体扩散到固定化酶外表面的速率应表示为： 1 外扩散速率对酶催化反应速率的限制外扩散速率对酶催化反应速率的限制 定态条件下，应存在Rsi=Rsd，即 该式表示了在定态条件下，外扩散传质速率等于在固定化酶外表面上底物 反应速率。 (1) 当外扩散
11、传质速率很快，而固定化酶外表面反应速率相对较慢时, 并 成为该反应过程速率的控制步骤时，酶的外表面上底物浓度应为液相主 体溶液的浓度，即为S，此时的反应速率应为： 反应最 大速率 反应最 大速率 ) 342( )( max + = sim si siL SK Sr SSak )442( 0 max = + = s m si r SK Sr R 1 外扩散速率对酶催化反应速率的限制外扩散速率对酶催化反应速率的限制 (2) 当外扩散传质速率很慢，而酶表面上的反应速率很快，此时外扩散速率 成为反应的控制步骤。固定化酶外表面上底物浓度趋于零。 故： 上式为在此条件下可能的最大传质速率，用rd表示。 扩
12、散最大速率扩散最大速率 )542(= dLsi rSakR 从下图可以看出：从下图可以看出： (1) 当当S 值较低时，值较低时，rs0rd，为外扩散控制，此时有，为外扩散控制，此时有 (2) 当当S 值较高时，值较高时，rs01时，则底物最大扩散速率要大大慢于酶催化底物的反应速率， 此时该反应过程为传质扩散控制。 最大传质速率 最大反应速率 =Da (2) 引入外扩散有效因子引入外扩散有效因子 。为一级反应动力学特性 示为：此时反应宏观速率可表 ，扩散控制时，因此，当反应过程为外 1* SakRsi Da L = 本征反应速率。反应速率实际上反映了的影响时所测得的宏观 外扩散高流体流速。在消
13、除了值。一个有效方法是提即提高 值尽可能小，应控制操作条件使尽可能增大到为了使 ，并有：学控制时，当反应过程为反应动力 ak rR Da L out sosiout Da1 , 1 1* = 0.3，则有in1，反应为内传质所限制。因此，克服内传质阻力， 减少值有3种方法： ?减少颗粒直径。 ?降低rmax(正比k+2E) ?通过温度等条件调节rmax/De 主要变量rmax和R,在给定条件 下Km与De为定值，所以 2 内扩散限制效应内扩散限制效应 ?Kobayashi等提出一近似解法为： ?对膜状固定化酶：a=b=1 ?对球形固定化酶：a=2.6,b=0.8。 ?0为零级动力学有效因子，求其0值时，令 k0=rmax;从图中查到0的值。 ?1为一级动力学有效因子，求其1值时，令 k1=rmax/Km; b s m b s m S K a S K a ) (1 ) ( 10 + + = 5 P51 20
