《常见革兰阴性杆菌耐药性和消毒剂磺胺耐药基因的检测及分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《常见革兰阴性杆菌耐药性和消毒剂磺胺耐药基因的检测及分析（41页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、摘要 目的 了解临床常见革兰阴性杆菌分离菌株对常用抗菌药物的耐药现状及其抗 消毒剂基因的携带情况，为临床治疗感染性疾病提供科学依据。 方法采用B DP h o e n i x l 0 0 全自动微生物分析仪鉴定细菌；药敏试验采用K B 琼 脂纸片扩散法：聚合酶链反应( P C R ) 检测抗消毒剂基因和磺胺耐药基因 ( q a c E A l - s u l l ) 。 结果临床共分离2 0 8 株革兰阴性杆菌，其中大肠埃希菌4 9 株，肺炎克雷伯 菌5 3 株，阴沟肠杆菌1 0 株，铜绿假单胞菌4 8 株，鲍曼不动杆菌4 8 株。主要分布 于I C U 、呼吸科、肾内科、老年内科和神经科病房
2、，不同细菌在不同科室分布有差 别。临床常用抗生素中，肠杆菌科临床分离菌株耐药率低于2 0 的抗生素有阿米 卡星、亚胺培南、美洛培南、哌拉西林他唑巴坦和头孢哌酮舒巴坦；耐药率高于 8 0 的抗生素有氨苄西林。临床分离的非发酵菌菌株中，铜绿假单胞菌耐药率低 于3 0 的抗生素有阿米卡星、妥布霉素、哌拉西林他唑巴坦和头孢哌酮舒巴坦；耐 药率高于9 0 的抗生素有头孢唑林、头孢呋肟、氨苄西林、氨苄西林舒巴坦和呋哺 妥因。鲍曼不动杆菌对抗生素的耐药水平普遍较高，耐药率低于4 5 的抗菌药物有 哌拉西林他唑巴坦和头孢哌酮舒巴坦。耐药率高于9 0 的抗菌药物有头孢唑林、头 孢呋肟和呋喃妥因。 2 0 8 例
3、革兰阴性杆菌分离菌株中，有1 0 4 株携带q a e E A l s u l l 基因，总阳性率为5 0 。其中鲍曼不动杆菌中携带q a c E A l s u l l 基因阳性率高达7 5 ， 其次是大肠埃希氏菌为6 9 4 ，2 种菌株q a c E A l s u l l 基因携带率明显高于其它菌株 ( P t1 81 5 1 7 1 4 头孢他啶( 3 0 “g ) 1 2 1 1 8 2 0 1 7 头孢两丁( 3 0 “g ) - 1 8 1 5 1 7 1 4 头孢唑林( 3 0 p g ) I1 81 5 1 7 1 4 I I I I1 莉( 3 0 t t g ) 1 2
4、 2 1 6 2 1 1 5 环丙沙星( 5 “g ) 1 2 1 1 6 2 0 1 5 美洛培南( 1 0 p g ) 1 1 61 4 1 5 1 3 庆大霉素( 1 0 p g ) 1 5 1 3 1 4 1 2 皿胺培南( 1 0 p g ) 1 1 6 1 4 1 5 1 3 头孢呋新( 3 0 “曲 i 2 3 1 5 2 2 1 4 哌拉西林他唑巴坦( 1 0 0 1 0 p 曲 2 l 1 8 2 0 1 7 复方新诺明( 1 2 5 2 3 7 5 r i g ) 1 6 1 1 1 5 l O 头孢曲松( 3 0 p g ) 2 l 1 4 2 0 1 3 氨苄两林( 1
5、 0 p g ) I 1 5 1 2 1 4 1 1 氨苄两林舒巴坦( 1 0 门O p g ) 1 1 7 1 4 1 6 1 3 头孢哌酮舒巴坦( 7 5 1 0 p g ) I 2 11 6 2 0 1 5 璧堕墨旦Q ! ! 竖2 至! ! ! ! 二! ! 三旦一一 _ - - _ l - _ - _ _ - _ - _ _ _ _ - l _ - l - I - - _ - - - - - - - _ _ - _ _ _ _ - _ _ _ I _ - l l l l _ _ - 。l _ l _ 。1 一一 M H 琼脂的制备 ( 1 ) M H 琼脂为商用脱水培养基，按照使用说
6、明书制备培养皿。 ( 2 ) 高压灭菌后立即水浴冷却至4 5 5 0 “ C ( 3 ) 将新鲜制备并冷却的培养基以无菌操作的方式倾注至一次性塑料无菌培养 皿中，厚度应均匀一致，约4 m m 。 ( 4 ) 琼脂培养基应冷却至室温，若当天不使用，应贮存于冰箱中( 2 8 ) 。 4 第一章材料与方法 ( 5 ) 培养基应于制备后7 天内使用，但若采用充分的防范措施，减缓琼脂干燥 如使用塑料包装，或用质控菌株进行试验，结果仍然正确，则可延长使用期。 ( 6 ) 每批平板都应进行抽样检测，在3 0 “ - 3 5 “ C 培养箱孵育2 4 h 或更长时间以检 查其无菌性。 制备接种物的浊度标准 (
7、 1 ) 将0 5 m L0 0 4 8 m o l L 的B a C l 2 加入到9 9 5 m L0 1 8 m o l L 的H 2 S 0 4 中并不断搅 动以维持混匀状态。 ( 2 ) 浊度标准的正确浓度应采用分光光度计检测吸光度证实。在6 2 5 n m 处的吸 光度值应为0 0 0 8 “ - - - 0 1 0 ，即等于O 5 号麦氏标准管，此管即为制备接种物的浊度标 准。 ( 3 ) 按每管4 “ - - 6 m L 将硫酸钡悬液分装于带旋盖的试管中，试管型号应与培养或 稀释接种菌所用的试管一致。 ( 4 ) 这些试管应密封并贮存于室温黑暗处。 ( 5 ) 在使用前，应将浊
8、度标准管置于涡旋混匀器上剧烈振动，目测其外观浊度 应均匀一致。若有大颗粒出现，此标准管应更换。 接种物的制备和平板接种 ( 1 ) 从培养1 6 “ - - - 2 4 h 的琼脂平板上( 应用非选择性培养基，如血琼脂平板) 挑取单 个菌落，直接用肉汤或盐水制成悬液作为接种物，此悬液浊度应调整至0 5 麦氏标 准管。 ( 2 ) 接种物悬液的浊度调整后，最好在1 5 m i n 内接种，用无菌棉拭子蘸取调整 好浊度的菌液，在液面上方管壁处旋转并用力挤压，以挤出过多的接种菌液。 ( 3 ) 用蘸取菌液的棉拭子在无菌稍干燥的M H 琼脂表面划线接种，再重复操作 2 次，每次将平板转动6 0 度角，
9、每次接种都应保证接种物均匀分布，最后用棉拭子 涂抹琼脂的边缘。 贴加药敏纸片 ( 1 ) 将用于药敏试验的抗生素组合纸片分贴至接种临床分离菌株的琼脂平板表 面，每个纸片注意轻轻下压以保证与琼脂表面完全接触。不管纸片是单个贴加还是 用分配器贴加，都应均匀分布，使其中心问距不小于2 4 m m 。因为有些药物几乎会 立即扩散，所以纸片一旦接触琼脂表面，就不应再挪动位置，而应该在需要的地方 贴新的纸片。 ( 2 ) 贴完纸片后，应在1 5 m i n 内，将平板反转过来，置于3 5 温箱中。 5 青岛大学硕士学位论文 结果判断与分析 ( 1 ) 孵育1 6 1 8 h 后，检查每块平板，如果平板划线
10、满意，接种物准确无误， 抑菌圈应为正圆形，菌落应相互融合生长。如果出现明显的单个菌落，是因为接种 量太少，必须重复试验。测量应该包括完全抑制区域的直径，包括纸片的直径。 ( 2 ) 抑菌圈的边缘应是肉眼观察无细菌明显生长的区域，如果抑菌圈边缘有微 小菌落生长，而且只有用放大镜才能看到，这些菌落就应该忽略。 ( 3 ) 抑菌圈大小的解释可根据N C C L S 标准进行敏感、中敏和耐药的判断。 1 3 3 抗菌药物的选用 药敏纸片包括氨基糖甙类抗菌药物：阿米卡星( A m i k a c i n ，A M K ) 、妥布霉素 ( T o b r a m y e i n ) 和庆大霉素( G e
11、n t a m i c i n ，G E N ) ；D 内酰胺类抗生素：头孢吡肟( C e f e p i m e ， F E P ) 、头孢他啶( C e f t a z i d i m e ，C A Z ) 、头孢唑林( C e f a z o l i n ，C F Z ) 、氨曲南( A z t r e o n a m ， A T M ) 、氨苄西林( A m p i c i l l i n ，A M P ) ；碳青霉烯类抗生素：亚胺培南( I m i p e n e m ，I M P ) 美洛培南( M E M ) ；喹诺酮类抗生素：环丙沙星( C i p r o f l o x a
12、c i n ，C I P ) ：抗生素复合制 剂：哌拉西林他唑巴坦( P i p e r a c i l l i n T a z o b a c t a m ，T Z P ) 、氨苄西林舒巴坦 ( A m p i c i l l i n S u l b a c t a m ) 、头孢哌酮舒巴坦( C e f o p e r a z o n e S u l ) ；磺胺类抗生素：复方新 诺明( C o m p o u n ds u l f a m e t h o x a z o l e ，S X T ) 。其中I M P 、G E N 、C T X 和C A Z 由英国O x o i d 公司提供
13、，其它药敏纸片由北京天坛生物制品股份有限公司提供。 1 4 细菌D N A 模板的制备 采用煮沸法直接提取细菌D N A ，制备P C R 模板，步骤如下： ( 1 ) 将临床分离菌株菌种进行编号。 ( 2 ) 取O 5 m l 无菌E p 管进行编号，于每管内加入2 0 0 1 a l 双蒸水。 ( 3 ) 挑取纯培养典型细菌菌落少许置入相应离心管中，混匀后离心。 ( 4 ) 用封口膜将离心管密封，防止煮沸时离心管盖打开。 ( 5 ) 将加入细菌的离心管置1 0 0 水浴l O m i n ，然后8 0 0 0 r m i n 离心3 0 s 。 ( 6 ) 吸取上清液移入另一新的O 。5
14、m l 离心管作为q a c E A l s u l l 基因检测模板液， - 2 0 冰箱备用。 1 5q a c E 1 - - S U1 1 基因检测 1 5 1 引物合成 参考文献设计扩增q a c E A l s u l l 基因引物，P C R 弓I 物和耐药基因扩增试剂盒由江 苏无锡市克隆遗传技术研究所提供，I 类整合子中q a c E l 与s u l l 基因为重叠基因， 6 第一章材料与方法 本实验在q a c E A l 下游设计引物P 1 ，在s u l l 上游设计引物P 2 ，引物序列如下：P 1 ： 5 一T A G C G A G G G C T r T A C
15、 T A A G C 一3 ，P 2 ：5 A T T C A G A A T G C C G A A C A C C G 3 。P C R 扩增后阳性产物为3 0 0 b p ，P C R 扩增阳性表示q a c E A l 与s u l l 基因同 时存在。 1 5 2 引物工作液的制备 ( 1 ) 取出引物，因为引物呈薄膜状或粉末状附在离心管中，使用前应先高速瞬 时离心再小心开启，以免引物丢失。 ( 2 ) 根据各离心管标记的微摩尔数不同，而向各离心管内加入不同等量的无菌 蒸馏水，合上离心管盖，震荡使其充分溶解，制成引物原液于2 0 “ ( 2 保存备用。 ( 3 ) 将引物原液按l ：
16、1 0 ( 1 0 9 l 原液+ 9 0 9 lP C R 专用水) 稀释，然后离心，以备P C R 扩增用。 1 5 3q a c E A l s u l l 基因检测步骤 q a c E A l 与s u l l 基因检测的操作在冰上进行，具体操作步骤如下： ( 1 ) 根据待测基因的菌株数目，计算反应体系中各成分的用量。 ( 2 ) 取0 5 m lE P 管进行编号，做好标记。 ( 3 ) 取1 5 m lE P 管置于冰盒上，依次加入反应体系中的各成分，注意最后加入 T a qD N A 聚合酶，充分混匀后离心。 ( 4 ) 将O 5 m lE P 管打开盖子依次置于冰盒上，每管加入2 2 9 l 事先配好的P C R 反 应液，然后依次向相应0 5 m lE P
