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1、重庆医科大学 硕士学位论文 川楝素提取物的制备和抗肿瘤机理研究 姓名：刘小玲 申请学位级别：硕士 专业：临床检验诊断学 指导教师：何於娟 20090501 重庆医科大学硕士研究生学位论文 川楝素提取物的制备和抗肿瘤机理研究 摘要 目的：通过对T S N 提取物诱导人慢性髓系白血病K 5 6 2 细胞凋亡 和抑制荷瘤小鼠肿瘤生长的试验，探讨T S N 提取物的抗肿瘤活性及其 作用的分子机制。 方法：1 自建改良的超声波萃取一高效液相色谱法分离、检测川楝 树树皮提取物中的T S N ，建立一种简便、快速、准确的实验室少量制 备和鉴定T S N 的方法。2 用不同浓度的T S N 提取物处理K 5
2、6 2 细胞， 采用M T T 比色法检测细胞增殖抑制率；W i g h t S 染色，在普通光镜下 观察细胞的形态学改变；流式细胞技术检测细胞周期与凋亡率的变化； A n n e x i nV P I 双标记法检测早期和晚期凋亡效应的变化；D N A 琼脂糖 凝胶电泳观察凋亡细胞D N A 片段化；比色法检测C a s p a s e 3 、8 、9 相 对活性的改变；R T - P C R 检测凋亡相关基因P 2 1 、B c r a b l 、H r a sm R N A 表达水平的改变。3 采用小鼠H 2 2 肝癌细胞实体瘤模型进行体内抑瘤 实验，观察荷瘤小鼠的生长情况和肿瘤生长曲线，
3、测定肿瘤生长抑制 率；摘取脾脏、胸腺和肺，计算脾指数、胸腺指数和结节抑制率；肿 瘤组织和肝脏组织的病理学切片进行H E 染色形态学观察，肿瘤组织的 超微结构行透射电镜观察；采用免疫组织化学法检测肿瘤组织细胞 B a x 、B c l 2 、F a s 的表达。 结果：1 T S N 在4 6 4 - - 一8 8 2 p g m l 浓度范围内有良好的线性关系 重庆医科大学硕士研究生学位论文 ( 严O 9 9 9 6 ) ，测定方法平均加标回收率为1 0 0 8 3 ，精密度试验R S D 为1 4 2 ，稳定性试验R S D 为2 2 6 。提取物中T S N 经H P L C 分离提 纯后
4、纯度达9 6 3 2 。2 T S N 提取物显著抑制K 5 6 2 细胞的增殖，并呈 剂量时间依赖性，作用7 2 h 的I C 5 0 - - 2 1 0 8 m o l l ：处理组细胞在普通 光镜下可见典型的凋亡形态学改变；细胞周期和A n n e x i nV P I 双标记 检测表明T S N 提取物可诱导K 5 6 2 细胞凋亡，并呈剂量时间依赖性； 处理组细胞D N A 琼脂糖凝胶电泳出现明显的梯形条带；处理组细胞 C a s p a s e 3 、8 、9 的活性均显著增加；P 2 1 、H r a s 表达上调，b c r a b l 表 达下调。3 T S N 提取物对小鼠
5、的H 2 2 实体瘤生长具有明显的抑制作用， 抑瘤率达5 0 以上。T S N 提取物组小鼠的肿瘤生长较对照组慢。脾指 数和胸腺指数明显低于对照组( P 1 9 5 ) 定标，乙醇溶解，配成1 1 9 8 5 1 0 。3m o l 1 储 存液，过滤除菌，一2 0 冰箱保存，使用时以R P M I1 6 4 0 培养基稀释成所需浓度( 培 养液中乙醇浓度 O 0 2 ) 。 1 7 重庆医科大学硕士研究生学位论文 1 2 方法 1 2 1 细胞培养 ( 1 ) K 5 6 2 细胞株 K 5 6 2 细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所，常规培养于含l0 胎牛 血清的R P M l l
6、6 4 0 培养基( 含青、链霉素各1 0 0 U m 1 ) 中，置于3 7 、5 C 0 2 、， 饱和湿度的混合气体培养箱中培养，2 “ - - 3 天换一次液，3 - - - 5 天细胞长到8 0 左右 传代培养。 ( 2 ) 正常人外周血单个核细胞 正常成人外周血单个核细胞采用f i c o l 液提取，把全血离心1 5 0 0 转分，5 分钟， 弃去上面的血清，将剩下的血细胞用H a n k s 液稀释2 倍，缓慢倒在5 m l f i c o l 液上，离 , 5 , 2 0 0 0 转2 5 3 0 分，取上清和红细胞之间的液体，用P B S 稀释5 倍后再离心1 0 0 0
7、转 分，5 分钟，取瓶底沉淀即为单个核细胞。 提取的单个核细胞按1 2 1 1 条件常规培养可存活一周。 1 2 2M T T 增殖实验 采用人类髓系白血病K 5 6 2 细胞株和正常成人外周血单个核细胞，在含1 0 胎 牛血清的R P M I - 1 6 4 0 培养液中，5 C 也，饱和湿度，3 7 条件下常规传代培养。 将对数生长期的K 5 6 2 细胞配成单细胞悬液，浓度为1 1 0 4 个m 1 ，取2 0 0l al 加入9 6 孔细胞培养板中，分别加入不同浓度T S N 提取物，实验设计分7 组： 溶剂对照组( 加入0 0 2 无水乙醇) 、对照组( 加入等量细胞悬液) 、T S
8、 N 提 取物组( 终浓度分别为0 5 、l 、2 、3 、4 1 0 - 8 m o l L ) 。同时设立正常成人 外周血单个核细胞对照组( 加入等量细胞悬液) 和正常成人外周血单个核 细胞处理组( 加入终浓度为4 1 0 8 m 0 1 L 的T S N 提取物) ，每组设5 个平行孔。 常规培养2 4 、4 8 、7 2 、9 6 和1 2 0 h 后，各孔均加入5 m g m 1 的M T T 溶液2 0pl ， 继续培养4 h 。 离心弃上清，加入D M S 0 1 5 0l J1 ，振荡1 0 m i n ，使孔中蓝紫色结晶物充分溶解， 混匀后以酶标仪于4 9 2 n m 处读取
9、各孔吸光度值( 0 D 4 9 2 ) ，记录结果，实验重 复3 次，取每次各浓度孔0 D 埘值的均值作为该浓度的最终光密度值。计算抑 1 8 ) ) ) ) l 2 3 4 ( ( ( ( 重庆医科大学硕士研究生学位论文 制率和半数抑制浓度( I C 5 0 ) 。 抑制率= ( 1 - - O D 啪药物组0 D 抛对照组) 1 0 0 I C 5 0 = e u 窖最大剂量一1 暑最大利量相铝捌量1 阳性反应牵之和一3 一最大阳性反应宰一最小阳性反应辜4 1 1 2 3 细胞形态学观察 将对数生长期的K 5 6 2 细胞用含1 0 胎牛血清的R P M I 一1 6 4 0 完全培养基配
10、成浓 度为1 1 0 5 个m l 的单细胞悬液，取6 m l 接种于培养瓶中。实验分为T S N 提取物 处理组( 终浓度分别为1 1 0 一、2 1 0 _ 8 m o l L ) 和对照组，培养3 、6 d 后，W r i g h t S 染色，光学显微镜下观察细胞形态变化。 1 2 4 细胞周期和细胞凋亡率分析 实验分为2 1 0 8 m o l L T S N 提取物处理组和对照组。收集培养2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 的所有细胞，8 0 0 r p m 离心5m i n ，去上清液，P B S 漂洗两次后收集细胞，加入7 0 的冷乙醇固定，4 冰箱过夜，P B S 洗涤去
11、乙醇，8 0 0r p m 离心5m i n ，去上清液， 0 5m lP B S 重悬细胞，同时加入碘化丙啶( P I ) 染色3 0 m i n ，用F C M 测定细胞周 期各时相细胞的百分比及细胞凋亡率。 1 2 5A n n e xinV PI 双标记法检测凋亡效应 实验分为2 1 0 8 m o l LT S N 提取物处理组和对照组。离心收集处理2 4 、4 8 h 的K 5 6 2 细胞1 1 0 6 个m l ，P B S 洗2 次，用1 ：4 的b i n d i n gb u f f e r1 9 0ul 重悬细胞， 加入A n n e x i n V - F I T C
12、5 u1 和2 0 ug m lP Il O I l1 ，置冰上作用l O m i n ，用F C M 检测细 胞的凋亡效应。 1 2 6D N A 琼脂糖凝胶电泳分析凋亡细胞D N A 片段化 ( 1 ) 收集2 l O - - 8 m o l LT S N 提取物作用后的K 5 6 2 细胞悬液，经P B S 洗涤， 1 0 0 0 - 2 0 0 0 9 离心1 - 2 分钟，弃上清，收集细胞约2 1 0 6 个。 ( 2 ) 每l m l 样品裂解液中加入5 u l 蛋白酶K ，混匀。 ( 3 ) 在收集的细胞中加入i m l 添加了蛋白酶K 的样品裂解液，震荡混匀，充分裂 解细胞。
13、( 4 ) 5 0 水浴笑话过夜，加入5 0 0 u l T r i s 平衡苯酚，剧烈震荡混匀，使有机相和 1 9 重庆医科大学硕士研究生学位论文 水相充分混合，4 “ C ，1 2 0 0 0 9 离心5 分钟。 ( 5 ) 缓慢吸出酚相及中间相( 可以吸除少量靠近中间相的水相液体) ，剩余的水 相用等体积T r i s 平衡酚再抽提一次。 ( 6 ) 慢慢吸出约3 0 0 u l 上清液，加入6 0 u ll O m o l l 醋酸铵和6 0 0 u l 无水乙醇， 颠倒数次混匀，此时即可见D N A 沉淀产生。一2 0 。C 冻存1 小时，充分沉淀小片段D N A 。 ( 7 ) 4
14、 “ C ，1 2 0 0 0 9 离心1 0 分钟，弃上清。 ( 8 ) 加入6 0 0 u l7 0 乙醇，轻轻颠倒约2 次，4 “ C ，1 2 0 0 0 9 离心1 0 分钟，小心吸 去上清。 ( 9 ) 加入1 7 u iT E ，溶解D N A ，加入3 u lD N Al o a d i n gb u f f e r ，上样量为2 0 u l ， 经1 琼脂糖凝胶电泳。 1 2 7C a s p a s e - - 3 、8 、9 活力检测 实验分为2 1 0 一S m o l LT S N 提取物处理组和对照组。离心收集处理7 2 h 的K 5 6 2 细胞，P B S 洗2
15、 次，加入5 0 u lL y s i sB u f f e r 和0 5 u1D T T ，置冰上作用4 0 r a i n ， 离心收集上清液，加入5 0 u l2 R e a c t i o nB u f f e r 和0 5I J1D T T ，再分别加入5 u l C a s p a s e - - 3 、8 、9 底物，3 7 避光孵育4 h ，用酶标仪测定4 0 5 r i m 处的吸光度值 ( A 4 0 5 ) 。 1 2 8R T - P C R 检测凋亡相关基因m R N A 表达的影响改变 采用总R N A 抽提试剂盒，提取总R N A 。采用P r i m e S c
16、 r i p t 伯逆转录试剂盒，反 应体系为：5 逆转录缓冲液2 u l 、逆转录酶0 5 u l 、o l i g od T ( 5 0 u m o l L ) 0 5 u l 、 随机引物( 1 0 0 u m o l L ) 0 5 u l 、总R N A5 0 0 n g 、R N a s eF r e ed H ：0 加至l O u l ，反应条 件为：3 7 “ C1 5 r a i n ，8 5 。C 5 s 。2 0 u lP C R 反应体系：T a k a R aT a q 酶( 5 U u 1 ) 0 1 u l 、 I O XP C Rb u f f e r ( M 9 2 + f r e e ) 2 u l 、M g C l 2 ( 2 5 m m o l L ) 1 2 u
