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1、福建医科大学 硕士学位论文 血管内皮细胞生长因子在大鼠原位肝移植慢性排斥反应中的表 达及意义 姓名：黄启明 申请学位级别：硕士 专业：外科学（肝胆外科） 指导教师：刘景丰 20100301 福建医科大学2 0 0 7 级硕士石叶究生论文 中文摘要 V E G F 在大鼠原位肝移植慢性排斥反应中的表达及意义 目的 建立大鼠原位肝移植慢性排斥反应模型，观察V E G F 在慢性排斥反应移植肝组 织中的表达，探讨其在慢性排斥反应发生发展中的作用。 方法 1 建立大鼠原位肝移植慢性排斥反应模型：近交系L e w i s 大鼠为供体，B N 为受 体，改良K a m a d a 二袖套法建立大鼠肝移植模
2、型，实验分为3 组，A 组：L e w i s B N + 生理盐水组( 生理盐水l m l k g d 皮下注射，手术当天至死亡；n = 2 0 ) ；B 组：L e w i s - - - B N + C s A 组( C s Al m l k g d 皮下注射，手术当天至术后3 0 d ；n = 3 2 ) ；C 组( 对照组) ： L e w i s L e w i s + C s A 组( C s Al m l & d 皮下注射，手术当天至术后3 0 d ；n = 3 2 ) 。各 组分别于术后1 d 、6 d 、1 0 d 、2 1 d 、3 0 d 、6 0d 取肝脏组织，H E
3、 染色、V G 染色、 网状纤维染色、C K l 9 免疫组织化学观察肝脏病理改变。 2 免疫组织化学观察大鼠肝移植后发生慢性排斥、急性排斥以及同品系的移植肝 组织V E G F 的表达。 结果 1 A 组大鼠原位肝移植术后6 d 表现为中度急性排斥反应，R A I 评分6 7 分；随 着移植时问的延长急性排斥反应进行性加重，到1 0 d 或临终状念时表现为重度急 性排斥反应，R A I 评分8 9 分。 2 B 组随着移植时间的延长慢性排斥反应进行性加重，表现移植肝纤维化逐渐加 重；汇管区胆管逐渐减少。术后6 0 d 可见典型的慢性排斥反应表现：R A I 评分9 1 2 分：胆管炎性损伤；
4、动脉管腔狭窄或完全闭塞；汇管区显著扩大；中央静脉局灶 性闭塞和不同程度的炎症；严重者可见肝硬化改变。 3 C 组未见明显免疫排斥反应，R A I 评分0 3 分，术后6 d 几乎接近F 常肝组织。 4 A 组、B 组、C 组术后1 d 移植肝组织均可见肝细胞V E G F 表达明显升高，之后 2 福建医科大学2 0 0 7 级硕士研究生论文 趋势各异。A 组肝细胞V E G F 表达程度随时问推移而持续增高。B 组肝细胞术后 6 d 达到高峰后开始下降，术后1 0 d 后表达又复增强并保持较高水平。C 组肝组织 术后6 d 表达开始逐渐下降并保持较弱水平，术后6 0 d 几乎未见V E G F
5、 表达。 5 术后1 d 各组V E G F 表达差异无统计学意义( P 0 0 5 ) ；术后6 d ，B 组与A 组、 C 组差异无统计学意义( P 0 0 5 ) 。术后1 0 d ，B 组表达低于A 组( P O 0 5 ) A td a y 10 ，t h e r ew e r es t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e sa m o n gt h et h r e eg r o u p s ( P O0 5 ) 。术后1 0 d B 组血清T B I L ，A L T 浓 度均明显高于C 组( P 0 0 5 ) 。术后1 0 d ，
6、 B 组表达低于A 组( P 0 0 5 ) ，B 组高于C 组( P 0 0 5 ) 。术后2 1 d 、3 0 d 及6 0 d ，B 组 表达明显高于C 组( P 0 0 5 ) 。 3 4 福建斜 学2 0 0 7 诅幢士斗竟t 论 图3 - a 急排组术后1 0 dV E G F图3 - b 急排组术后1 0 dV E G F 阳性表达( D A B 2 0 0 阳性表达( D A B 4 0 0 ) _ ， 幅建医抖 学2 0 0 7 垃嘎士研竟t 论文 图4 - a 慢排组术后6 0 d V E G F 阳性袁达( D A B 2 0 0 ) 03 5 03 02 5 0 2 坌
7、 015 0l 00 5 圈4 _ b 慢排组术后6 0 d V E G F 阳性表达( D A B 4 0 0 ) 61 02 1：m6 0 u f M d ) 图5 术后各组V E G F 表达变化 ：急捧组与慢持组相差异有统目学商望( P 00 5 ) ：同- R e 阃点与同品系组相比差异有缝日学意义( P O0 5 讨论 ，急捧组 慢捧组 同品系组 肝移植已经成为大家公认的治疗终末期肝病有效的治疗方法。虽然随着外科 技术的进步、器官保存方法的提高以及新的免疫抑制荆的出现，肝移植生存率得 到了明显提高，近2 0 年来，C R 的发生率有了明显降低I 其发生率由上世纪8 0 年代的1 5
8、 2 0 降至3 5 左右w ：国内大宗病例统计C R 的发生率也类似， 大约4 7 7 4 4 。避主要跟人们运渐认识及控制急性排斥和早期C R 以及肝脏强大的 3 6 福建医科文学2 0 0 7 级硕士研究生论文 再生能力有关。但是C R 仍然是晚期移植物失功和肝衰竭的重要原因【5 1 。目前对于 C R 的发病机制尚未明确阐明。目自仃认为除了与非免疫学机制如缺血再灌注损伤、 免疫抑制剂的毒副作用等有关外，主要是由免疫机制引起。细胞因子与移植排斥 反应密切相关，因为抗原刺激i F 是通过细胞因子介导引起免疫相关细胞活化，而 活化的免疫细胞F 是通过细胞因子的介导才发挥作用，从而导致排斥反应
9、的发生。 迄今有关V E G F 对心、肾脏移植后慢性排斥反应影响的报道较多，越来越多的研 究表明V E G F 在心、肾C R 的发展过程中可能有如下效应( 1 ) 作为炎症反应的调 节者。巨噬细胞和T 细胞可能会产生V E G F f6 1 ，另一方面，V E G F 促进单核细胞趋 化以及增加血管通透性。因此，V E G F 可能通过V E G F R 1 以自分泌的形式促进细 胞免疫应答【7 J 。( 2 ) V E G F 通过它的致动脉粥样硬化效应。V E G F 直接或者通过毗 邻细胞分泌的P D G F 增加平滑肌细胞( s m o o t hm u s c l ec e l
10、l ，S M C ) 的迁移，从而 促进移植物血管病的发生【8 】。另外，这些生长因子也是血管祖细胞动员、归巢及 分化的关键调节者1 9 】。血液循环中的V E G F R 2 阳性血管祖细胞在V E G F 和 P D G F B B 的刺激下分别分化为内皮细胞和S M C ，这可能也会促进移植物动脉粥 样硬化和C R 的发生【10 1 。但是V E G F 与肝移植后慢性排斥反应的关系尚不清楚。 V E G F 是1 9 8 9 年F e r r a r a 等【l l 】从牛垂体滤泡星状细胞的体外培养液分离出来 的一种促进血管内皮细胞有丝分裂的生长因子。V E G F 大小为3 4 “
11、- - , 4 5k D ，由分子 量为1 7 “ - - 2 2 k D 的两个相同亚单位通过二硫键构成的同源二聚体糖蛋白。人类 V E G F 基因位于染色体的6 p 2 1 3 ，含有8 个外显子。V E G F 的生物学功能：( 1 ) 促进内皮细胞增殖、血管生成及维持功能。V E G F 在胚胎发育、血管发生、淋巴 管发生及维持血管内膜完整性起重要作用。不论是在生理还是病理情况下，V E G F 对血管生成都起非常重要的作用。F e r r a r a 掣坦】发现V E G F 等位基因缺失或者敲除 编码V E G F R 的基因可导致胚胎因血管发生缺陷而死亡。V E G F 对整个
12、血管系统的 内皮细胞均有促有丝分裂作用，是目前所知最有选择性的血管内皮细胞促有丝分 裂剂。此外，V E G F 可刺激内皮细胞生成N O ，起到血管维持的功能。( 2 ) V E G F 增 加血管通透性，促进血液大分子外渗。V E G F 是目前所发现的最强的血管通透剂， 它在l m m o l L 浓度下即有活性，其活性是组胺的5 0 0 0 倍。V E G F 选择性直接作用 于血管内皮细胞膜上的两种特异性受体F M S 样的酪氨酸激酶l ( F l t l ) 受体和含 激酶插入区( K D R ) 受体后，最先观察到的生物学效应即胞质钙离子的增加，V E G F 在几秒内可使钙离子浓
13、度升高4 倍以上。V E G F 通过增加内皮细胞胞浆内C a 2 + 浓 3 7 福建医科大学2 0 0 7 级硕士研究生论文 度及使微血管( 主要是毛细血管后静脉及小静脉) 对大分子物质的通透性增高。 我们观察到不论是急排组、慢排组还是同品系组，术后第l 天就丌始见到肝 细胞明显表达V E G F ，并且持续增强，除急排组，其余两组在术后第6 天达到一 个高峰。在移植过程中不可避免的损伤造成的早期持续低氧状态所诱导表达的低 氧诱导因子I ( H I F 1 ) 是V E G F 生成表达的重要刺激因子【1 3 1 。M a r t iH H 等亦表明 体内外组织缺氧是上调V E G F 及
14、其受体表达的主要刺激信号，缺氧信号通过激活 V E G F 启动子区缺氧反应元件引起V E G F 表达增加。我们推测，V E G F 在大鼠肝 移植术后早期明显表达可能与肝移植过程中外科操作、移植肝缺血再灌注损伤以 及早期不可避免的缺氧状态有关。 本实验结果显示，在急排组V E G F 蛋白阳性表达见于肝细胞，汇管区炎症细胞。 V E G F 在急排组较同品系组明显表达，术后6 天和1 0 天，V E G F 表达水平比较具 有明显统计学意义，P 值分别为0 0 2 9 ，0 0 0 0 。急排组病理切片示术后6 天、l O 天表现为中重度急性排斥反应，而在同品系组对应时相点几乎无急性排斥反
15、应表 现。我们推测急排组V E G F 表达水平高于同品系组，可能与急性排斥反应的加重 有关。V E G F 通过促进单核细胞的趋化和粘附分子的表达促进炎症的发生【l 5 1 。 V E G F 可放大急性炎症反应和增强白细胞粘附及组织浸润【l 叫。暴露于V E G F 的内 皮细胞和巨噬细胞可激活转录因子N F r B ，促进前炎症性细胞因子和趋化性细胞 因子的合成【1 7 】。V E G F 通过增加毛细血管的通透性和内皮细胞P 粘附素表达，促 进巨噬细胞和白细胞粘附及浸润【1 8 】。在移植过程中不可避免的组织缺氧是V E G F 产生的主要刺激物。重新灌注时受体巨噬细胞和白细胞浸润移植
16、物后可能产生 V E G F 。在同种异体识别过程中，受体白细胞浸润移植物，进一步产生V E G F 。这 些增多的V E G F 进一步促进内皮细胞的通透性以及放大白细胞对移植物的浸润， 这可能导致排斥事件的发生f 1 9 】。结合本实验结果，我们可以认为V E G F 在大鼠肝 移植中积极促进A R 的发生。这与其他其他器官，如，t l , 脏、肾脏、肺、角膜等器 官移植得出的结论一样，V E G F 促进A R 的发生。 V E G F 在慢排组较同品系组明显表达，2 组术后1 0 天丌始，两组V E G F 的平 均光密度比较均具有明显统计学意义，P 值均小于0 0 l 。慢排组病理切片示术后 移植肝表现为进行性慢性排斥反应，而在同品系组对应时相点几乎无慢性排斥反 应表现。我们推测，V E G F 在慢排组的表达较同品系高，可能与与慢性排斥反应 发生有关。在慢性排斥反应发展过程中，V E G F 在可能在排斥反应的不同阶段由 3 8 福
