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1、分子生物学与生物化学实验 操作、设计与技能,DNA和RNA提取方法;酶切与连接。 李刚 副教授,二、DNA和RNA提取方法,细菌DNA的常规制备方法； 细菌DNA PCR模板的快速制备方法； 细菌基因组DNA提取试剂盒的选择； 酵母DNA的常规制备方法； 酵母DNA PCR模板的快速制备方法； 细菌基因组DNA提取试剂盒的选择；,二、DNA和RNA提取方法,植物、真菌DNA的小量制备方法； 植物（真菌）DNA extract Kit的选择； 动物组织或细胞中RNA的制备； 真菌（植物）RNA的制备； 植物和真菌RNA提取试剂盒的选择。 RNA提取过程中的注意事项； 鉴定所提RNA质量的方法和技
2、巧。,细菌DNA的常规制备方法,将培养后离心得到的菌体经过生理盐水洗涤2遍后，取TENS提取液（50mMTris.Cl, pH8.0, 20mM Na2EDTA,100mM NaCl, 1% SDS）3mL 于离心管中充分悬浮菌体.经100 C水浴保温2分钟后取出,待其自然冷却后,离心15分钟(8000g, 4 C), 收集其上清液。在其中加入0.6倍体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），离心15分钟（12000g, 常温）,保留上清液.然后再加入0.6倍体积的氯仿：异戊醇（24：1），再次离心15分钟（12000g,常温）,取上清.最后加入1/10体积的3M NaAC(pH5.2)和2.
3、5倍体积的无水乙醇，混匀，置于20C 30分钟，离心15分钟（12000g, 4C）,弃上清保留沉淀。并用75的乙醇洗涤沉淀，离心，控干后溶于100微升TE或无菌水中，加RNase至终浓度为20 g/mL, 37 C处理30分钟, 取少量电泳,其余放-20C保存备用。 该方法所提细菌DNA适于作为PCR反应的模板，如果该方法所提细菌DNA将用于建立基因组文库，则最好先将这些DNA用相应的细菌DNA提取试剂盒或DNA纯化试剂盒进行纯化后再用于建库。,细菌DNA PCR模板的快速制备方法（1）,微波炉法: 用接种环刮取大肠杆菌菌落,置于1.5mL eppendorf离心管里，加上20 L TE（p
4、H8.0）,振荡，盖上盖子。如果是菌液，则取1.5mL于13000r/min离心15秒，彻底倒尽上清液。用无菌双蒸水或TE洗涤一次， 13000r/min离心15秒，去上清，悬浮在残存液体里，盖上盖子。在750W家用微波炉高热处理30S，内置一盛水的烧杯，以免损坏微波炉。振荡1分钟，13000r/分离心2min。将上清储存在20 C。取12 L做为PCR反应的模板。,细菌DNA PCR模板的快速制备方法（2）,煮沸法： 用接种环刮取大肠杆菌菌落,置于1.5mL eppendorf离心管里，加上20 L TE（pH8.0）,振荡，盖上盖子。如果是菌液，则取1.5mL于13000r/min离心15
5、秒，彻底倒尽上清液。用无菌双蒸水或TE洗涤一次， 13000r/min离心15秒，去上清，悬浮在残存液体里，盖上盖子。在沸水上煮2min。13000r/min离心2分钟。将上清储存在20C。取12 L做为PCR反应的模板。 通过多次实验的比较，个人认为煮沸法制备的细菌DNA PCR模板的质量和方法的重复性，要优于微波炉法。,细菌基因组DNA提取试剂盒的选择,首选QIAGEN公司的，因为其核酸提取试剂全球领先，因而其种类最全。当然价格也比较昂贵。另外，有非常多的国内公司都生产细菌基因组DNA提取试剂盒，如：北京天根生化科技有限公司、广州东盛生物科技有限公司、杭州博日科技有限公司，北京百泰克生物技
6、术公司，广州誉维生物科技有限公司等。这些试剂盒的质量应该都可以满足要求。 这里推荐四款我用过的、效果不错的试剂盒供大家参考： DW09-1：细菌基因组DNA快速提取试剂盒（广州东盛生物科技有限公司）； E.Z.N.A.Bacterial DNA Kit(Omega公司，广州飞扬生物工程有限公司生产)； 细菌基因组DNA提取试剂盒 （北京天根生化科技有限公司） 快速DNA提取扩增套装 （北京天根生化科技有限公司）。 上述四款产品，前三款产品提取的DNA既可用于PCR，也可用于建库，而第四款产品提取的DNA只能用于PCR。,酵母DNA的小量制备方法（1）,实验原理： 首先酶解消化酵母细胞壁，制备原
7、生质体。然后用SDS裂解产生的原生质体，释放出基因组DNA，从而可以制备其总DNA。 程序： 、用YPD培养基培养酵母。将酵母培养物在30C、中度振荡条件下培养过夜，至OD6002.03.0(约为3107个细胞mL)。 2、取5mL 培养细胞置于离心管中.2000g(4100r/Min,Sorvall SS-34转头)离心5分钟,收集细胞.将剩下培养物置于4 C贮存. 3、用 0.5ml 山梨糖醇缓冲液（1 M山梨糖醇，0.1 M EDTA（pH 7.5）重新悬浮细胞。将细胞悬液转移到一只微量离心管中。 4、加入20l破壁的酶溶液(Lywallzyme,广东微生物所，用山梨糖醇缓冲液配成2.5
8、 mg/mL浓度)。将细胞悬液在37 C下温育1h. 5、用微量离心机离心1分钟，收集细胞，吸弃上清液。 6、用0.5ml酵母重悬缓冲液（50 mM Tris-Cl,pH 7.4, 20 mM EDTA, pH 7.5）重新悬浮细胞。,酵母DNA的小量制备（2）,7、加入50 l 10的SDS。盖上管盖，将离心管快速地翻转数次，混匀 后将离心管在65 C下温育30 min。 8、加入0.2 ml 5 mol/L 的醋酸钾溶液，冰浴1h。 9、在微量离心机中以最大转速4 C离心5min,使细胞碎片沉积下来。 10、室温下用粗孔吸头吸取离心上清，转移到一个新的微量离心管中。 11、加入等体积室温下
9、的异丙醇，沉淀核酸。将管内容物混匀，室温下 放置5min。(重要：不要使沉淀过程超过5min) 12、在微量离心机中以最大转速离心10s回收核酸沉淀。吸去离心上清 液，将沉淀在空气中干燥10min。 13、用300 l含20g/ml 胰Rnase的TE(pH8.0)溶解沉淀.将消化混合物 在37 C温育30 min。 14、加入30 l 3mol/L的醋酸钠(pH7.0).混匀后,加入0.2ml的异丙醇。 再次进行混匀。在微量离心机中以最大转速离心20s,使DNA沉淀。 15 吸去上清液，沉淀在空气中干燥10 min,用 150 l TE(pH 7.0)溶 解DNA。 本方法所得酵母DNA可用
10、作PCR或被限制性酶切割用于构建基因组文库。,酵母基因组DNA的两个简易制备方法(1),方法1：接种酵母菌种于无菌的50 mL YPD 或SD培养基,在30 C生长至对数生长晚期(至OD6002.03.0)。滤液4000 r/min离心10 min. 菌体用液氮研磨破壁. 加7 mL DNA 缓冲液(100mM Tris-HCl, pH8.0, 10mM EDTA,1%SDS)。混匀, 65 C保温 1 h. 10000 r/min离心15分钟。上清用苯酚抽提2次，每次5000 r/min离心7分钟。再用氯仿抽提一次，5000 r/min离心7分钟。用2.5倍乙醇沉淀（加0.3 M NaAC，
11、pH 5.2）, 10000 r/min离心10 min. 70%乙醇洗,电吹风吹干。加适量TE或水悬浮, 同时加适量RNase(20g/ml 胰RNase)。,酵母基因组DNA的两个简易制备方法(2),方法2：接种酵母菌种于无菌的50 mL YPD 或SD培养基,在30C生长至对数生长晚期(至OD6002.03.0). 滤液4000r/min离心10 min. 菌体用液氮研磨破壁. 加7mL DNA 缓冲液4mM spermidine（亚精胺）,40mM Tris-HCl, pH8.0, 10mM EDTA, 0.1M Nacl, 0.5%SDS, 10mM -mercaptoethanol
12、（ - 巯基乙醇）。混匀, 迅速用苯酚抽提，5000 r/min离心7分钟,重复一次抽提过程.再用氯仿抽提一次，5000 r/min离心7分钟。用2.5倍乙醇沉淀（加0.3 M NaAC，pH 5.2）, 10000 r/min离心10 min. 70%乙醇洗,电吹风吹干.加适量TE或水悬浮, 同时加适量RNase(20 g/ml 胰RNase)。,上述两个简易方法的比较和讨论,方法1和方法2制备的酵母DNA的得率分别为0.2 mg/L菌液和0.3 mg/L菌液。方法2的DNA缓冲液成份稍微复杂一点，但得率更高。两个方法都很简便，不用制作原生质体，可酶切分析和作为PCR模板。如果不加液氮研磨，
13、则方法1和2的得率分别减少至1520和510。,酵母DNA小量提取试剂盒,推荐 E.Z.N.A. Yeast DNA Kit.(Omega公司出品，飞扬公司生产) 一次可从1-3 ml酵母培养液中提取基因组DNA或质粒。 操作时间：60分钟左右。 得率：不高（几个微克），但较纯。 价格：900元/50次,很贵。 用途：纯化DNA产物可直接用于PCR、酶切和杂交等实验。,植物（真菌）DNA的小量制备方法,、首先，必须破碎（或消化）细胞壁释放出细胞内容物。常用的破壁方法是用匀浆器直接将植物组织磨成细粉；或者将新鲜植物组织在液氮中快速冷冻后，用研钵将其磨成粉。分离核DNA或细胞器DNA则应采取更为温
14、和的破壁方法，以免过早破坏内膜系统，人们通常采用在含渗透剂的缓冲液中C匀浆的方法来破壁。 、必须破坏细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中。这一步骤通常靠SDS或CTAB一类的去污剂来完成。去污剂还可以保护DNA免受内源性核酸酶的降解。通常提取缓冲液中还包含EDTA，它可以螯合大多数核酸酶所需的辅助因子镁离子。 、一旦DNA释放出来，其剪切破坏的程度必须要降到最低。剧烈振荡或小孔快速抽吸都会打断溶液中高分子量的DNA。一般说来，如果操作得当，可以得到相对分子质量长度为kb的DNA。 、在DNA粗提取中往往含有大量RNA、蛋白质、多糖、单宁、色素等杂质，大多数蛋白可通过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去，
15、绝大多数RNA可以通过RNaseA除去。但多糖一般很难除去。常使DNA提取物呈胶状而干扰后续操作。用玻璃钩钩出溶液中沉淀的絮状DNA而不是用离心获得DNA，可以有效减少DNA 中多糖的含量。,操作程序（1）,、将g经去淀粉处理的新鲜植物组织置于液氮中速冻，用研钵磨成细粉。 、将冷冻粉转移到一个ml离心管中并加入ml提取缓冲液500 mMNaCl, 100 mM Tris-Cl pH 8.0, 50 mM EDTA,pH 8.0, 10 mM -mercaptoethanal(用前加入)中，轻轻旋转混匀。 、加入mlSDS，混匀， C保温分钟，并不时轻轻旋转混匀（要点） 、加入5mL mol/L
16、 KAC,混匀后冰上放置分钟（要点） 、12g, 4 C离心分钟。 、上清用双层纱布过滤，转移至一干净的mL离心管中，加入mL异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20 C放置min沉淀核酸。 7、2000 g,4 C离心20 min,去上清,晾干沉淀5 min. 8 、用700 lTE缓冲液溶解沉淀并转移到一个eppendorf管中。（要点3）,操作要点,去淀粉处理：收获之前将植株于暗处放置24小时即可达到去除淀粉的目的。 1、将SDS溶液加入到化冻的提取物中时，可能会有沉淀析出，要保证析出的SDS重新溶解，以及65 C保温时提取物混合均匀。 2、在高浓度（1 mol/L）的钾离子存在的情况下，SDS会与蛋白或多糖结合变成不溶性的十二烷基磺酸钾复合物，这类复合物通常呈絮状，必须要经较高转速离心和纱布过滤予以除去。 3、若沉淀难于重新溶解，可在65 C加热10
