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1、生物学实验技术实操练习总结报告专业：生物工程 班级：2013级7班 组员：姜慧慧 2013203485王振 2013203491 陈汝斌 2013203496 米栋 2013203500王栋 2013203505 孙传磊 2013203506第一部分 实验玻璃器皿与常用工具的准备与设备调试一、玻璃器皿与常用工具：大号镊子、尖头镊子、剪刀、解剖刀柄、解剖刀片、酒精灯、喷雾器、烧杯（50 mL、100 mL、500 mL、1000 mL）、量筒（1000 mL、100 mL、25 mL）、容量瓶(1000 mL、500 mL、100 mL)、试剂瓶（1000 mL、500 mL、100 mL)、载
2、玻片、盖玻片、移液管、玻璃棒、药匙，PH试纸，锥形瓶，称量纸等。1、玻璃器皿的洗涤：一般玻璃器皿只要保证洁净即可，可用自来水洗净，再用普通蒸馏水冲洗，然后晾干即可。组织培养所用器皿和工具必须无菌，因此除正常洗净外，还须进行高压灭菌。载玻片、盖玻片的洗涤须用10%的盐酸酒精溶液浸泡后，再用95%酒精洗涤，然后用绸布擦干备用。须注意不可用其他布或纸张擦拭，以免次生污染。擦拭盖玻片要按课堂讲述的要领进行，以免受伤。2、常用玻璃器皿与常用工具的消毒培养瓶的灭菌待培养基配制完成进行适当分装然后封口后放入高压灭菌器中灭菌。各种镊子、剪刀、解剖刀柄、解剖刀片以及进行无菌切割等操作的垫纸、培养皿等须用报纸包裹
3、，外面再用耐热和塑料薄膜包裹后放入高压灭菌器中灭菌。3、高压灭菌器的使用A检查电路与设备完好。B打开灭菌锅盖，检查水量，如水量不足则须向锅内加入适量水。C将待灭菌的物品放入锅内，不要放的太多，以免影响灭菌效果。物品不要近靠锅壁，以免冷凝水顺壁流入物品中。装有液体的容器要注意不能倾斜、倒置。D加盖旋紧螺旋。四个螺栓应按对角顺序拧紧。E打开放汽阀，然后打开电源加热，设定工作温度和压力、工作时间，一般设定为温度120，消毒20min.自开始产生蒸汽后5 min，此时锅内的冷空气已由排气孔排尽，再关紧放汽阀，让温度随蒸汽压力的增高而上升。待压力逐渐上升到所需压力时（一般为15磅/时， 1.034105
4、 Pa）, 灭菌20 min。F达到灭菌时间后，系统会自动关闭，此时切记不可打开灭菌器，要让系统自行冷却，待压力降至0时，开盖，取出灭菌物品。G 培养瓶取出后整齐摆放在平坦桌面上冷却，在培养基凝固前不可使其晃动。其他工具与器皿放入超净工作台中备用。4、超净工作台的消毒与使用(1)操作者需穿着隔离衣，带好一次性口罩、帽子及医用乳胶手套。将一应需用物品有序地放入超净工作台。包括培养瓶、酒精灯、各种工具、消毒酒精瓶、消毒酒精棉球、废水杯等。(2) 超净工作台进行表面灭菌：先开启超净工作台上的紫外灯，紫外照射20 min以上。关闭紫外灯，使用前再用75%的酒精或0.5%过氧乙酸喷洒擦拭消毒工作台面，并
5、对操作者手及前臂用棉球进行擦拭消毒。(3)开启超净工作台工作电源，按照无菌操作规程操作。(4) 如遇机组发生故障，应立即通知实验动物室，由专业人员检修合格后继续使用。(5) 实验结束后，用消毒液擦拭工作台面，关闭工作电源，重新开启紫外灯照射15 min5、电子天平、电炉、光照培养箱、恒温培养箱等的使用与注意事项（略）。6、旋转切片机的使用第二部分 常用试剂的配制及玻璃器皿的使用一、常用试剂：硫酸重铬酸钾清洁液、10%盐酸酒精洗液、30%-95%梯度酒精溶液、二甲苯酒精溶液（1:2、1:1、2:1）、石蜡二甲苯饱和溶液、粘片剂、苏木精染色剂、铁矾媒染剂、1%铵水溶液、45%冰醋酸、1%蕃红水溶液
6、、1%固绿酒精(95%)溶液、加拿大树胶封片剂、卡诺固定液、Ms培养基大量元素、微量元素、有机物溶液、铁盐及植物激素母液、1%升汞消毒剂。二、各种化学试剂的配制按课程讲解的注意事项进行。三、培养基的制备1、培养基的主要成分：（1）水（2）无机成分：无机大量元素： 氮： 铵态氮、硝态氮混合 磷： 磷酸盐 钾： 钾盐 钙、硫、镁无机微量元素： 铁、硼、锰、锌、铜、钼、钴、氯（3） 有机成分： 糖、 维生素、肌醇、氨基酸及有机附加物。（4）植物生长调节物质： 生长素类： NAA、IAA、IBA、2,4-D 细胞分裂素类 ： BAP, KT，TDz，ZT 其他类： GA3, ABA， PP333（5）
7、琼脂2、培养基的制备MS培养基配方母液及取用量成分1升储备液用量(mg)每升培养基取用量( mL)20*储备液1（大量元素）NH4NO3KNO3CaCl22H2OMgSO47H2OKH2PO43300038000880074003400 100200*储备液2（微量元素）KIH3BO3MnSO44H2OZnSO47H2ONa2MoO42H2OCuSO45H2OCoCl26H2O166124044601720505510 1 200*储备液3（铁盐）FeSO47H2ONa2EDTA2H2O55607460 10200*储备液4（有机成分）肌醇烟酸盐酸吡哆醇盐酸硫胺素甘氨酸200001001002
8、0400 10铁盐：7.45gNa2-EDTA(乙二铵四乙酸二钠)和5.57g FeSO4.7H2O溶于1L水中，配1L培养基时取此液5 mL大量元素：将药品称取后分别溶解再依顺序混合定溶，配成10倍浓度的母液，每配制1L培养基时取母液100 mL微量元素：微量元素用量少，为称取方便精确，常配成100倍或1000倍的母液，每配制1L培养基时取母液10 mL或1 mL有机化合物：可配成100倍或1000倍的母液每配制1L培养基时取母液10 mL或1 mL激素的配制植物激素：配制成0.1-0.5 mg mL-1的溶液。萘乙酸（NNA）可溶于热水中或先溶于少量95酒精中再加水至一定浓度吲哚丁酸（IB
9、A）可先用少量0.4的NaOH溶液溶解，再加水到一定浓度吲哚乙酸（IAA）可先溶于少量95酒精中，再加水到一定浓度细胞分裂素：6-苄基嘌呤（6-BA）、激动素（KT）需用3.65的HCI或0.4 NaOH溶液先溶解后再加水到一定浓度3、培养基的配依次吸取大量元素、微量元素、有机物母液适量混合 300 mL水中放入琼脂7g加强完全溶化加入蔗糖30g搅拌使充分溶解注入混合液 搅拌均匀 用0.4的NaOH或3.65的HCl调节pH(5.7) 分装于三角瓶等培养容器内，用锡箔纸等将容器口封紧包好 放入高压锅中灭菌(1.1Kg/cm2压力,灭菌1520min) 取出冷却凝固备用。冷却后放到培养室预培养3
10、天，观察有没有杂菌污染 4、培养基中激素的添加(1)生长激素2,4-D(1 mg L-1) ： 准确称取2,4-D 20mg,用2 mL 95乙醇溶解，然后加水定容到20 mL。(2)细胞分裂素6-BA(1 mg L-1) ：准确称取6-BA 20 mg,用2 mL的1 mol L-1的NaOH溶解, 然后加水到20 mL。(3)NAA: 准确称取10mg,用少量1 mol L-1 NaOH溶解后加蒸馏水定容至100 mL,即配制成0.1 mg mL-1的NAA母液。用同样方法配制6BA母液，浓度为2 mg mL-1。转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于
11、冰箱中保存备用。（4）各种培养基的激素配比愈伤组织及芽诱导培养基： MSNAA 0.12.0 mgL-1（单位下同）6-BA 0.5； MSNAA 0.12.06-BA 0.5； MSNAA 0.12.06-BA 1.0；生根培养基: MSNAA 0.51.0； MSNAA 0.12.0； MSNAA 0.12.06-BA 0.05； MSNAA 0.12.06-BA 0.1； 1/2MSNAA 0.12.0； 1/2MSNAA 0.12.06-BA 0.05； 1/2MSNAA 0.12.06-BA 0.1。第三部分 菊花茎的组织培养一 实验目的掌握母液的配置和保存方法，配置培养基以及掌握培
12、养基灭菌的方法，掌握无菌操作技术，掌握生物无菌培养技术和知识。二 实验原理植物组织培养是把植物的器官,组织以至单个细胞,应用无菌操作使其在人工条件下,能够继续生长,甚至分化发育成一完整植株的过程.植物的组织在培养条件下,原来已经分化停止生长的细胞,又能重新分裂,形成没有组织结构的细胞团,即愈伤组织.这一过程称为“脱分化作用”,已经“脱分化”的愈伤组织,在一定条件下,又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官,这一过程称“再分化作用”.植物激素在此过程中起着重要的作用,吲哚乙酸（ IAA ）和 6 苄基氨基腺嘌呤（ 6 BA ）的比例,决定了根和芽的分化.三 实验器材（一）试剂 乙醇、IAA
13、 或 2 , 4 D 、HgCl 2 （或次氯酸钠）、6- 苄基氨基腺嘌呤（ 6-BA ）MS 培养基（二）仪器设备 培养室,高压灭菌锅,水浴锅,解剖刀,三角烧瓶（ 100mL ）,烧杯,量筒,培养皿,超净工作台,分析天平,长镊子,剪刀,橡皮筋等四 、实验步骤1. 配制培养基（ 1 ）愈伤组织诱导培养基： MS 培养基（蔗糖含量为 10 g/L , 2,4 D 含量为 2 mg/L ,琼脂 10 g/L ）.（ 2 ）试验培养基：在 MS 培养基中按表 33 1 加入 IAA 和 6BA .吲哚乙酸先用少量 0.1 mol/L NaOH 溶解, 6- 苄基氨基腺嘌呤先用少量 0.1 mol/L
14、 HCl 溶解,然后用蒸馏水稀释,再加入培养基中.2. 培养基灭菌将配好的培养基加入琼脂加热溶解,调至 pH 5.8 ,趁热分装于 100 mL 三角烧瓶中,每瓶约 20 mL .待培养基冷却凝固后,用两层称量纸包扎瓶口,并用橡皮筋扎牢,然后在高压灭菌锅中 121 （ 1 kg/cm 2 ）下灭菌 20 min .取出三角烧瓶放在台子上,冷却后备用.接种操作所需的一切用具（如长镊子、解剖刀、剪刀等）及灭菌水,需同时灭菌.3. 诱导产生愈伤组织 （ 1 ）取健壮的菊花茎数段,每段约 5 cm 长,于烧杯中用 0.1% 氯化汞（升汞）浸泡 20 min ,取出用无菌水洗 3 4 次,置于无菌培养皿中,在接种箱中按无菌操作要求剥去外皮（接种箱事先用紫外灯灭菌 30 min ）,用解剖刀切成 5 mm 厚的圆片（弃去开始一片和最后一片）,用长镊子将它接种在诱导培养基上,注意圆片的切口朝向培养基,每瓶接种 4 片,接种后扎好瓶口. （ 2 ）将已接入植物组织（外植体）的三角烧瓶,培养在 25 温室中
