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1、苏州大学 博士学位论文 肝细胞肝癌相关基因中miRNA结合靶点内多态的筛选及功能分析 姓名：何艳 申请学位级别：博士 专业：药理学 指导教师：谢梅林;刘海燕 20100301 肝细胞肝癌相关基因中 miRNA 结合靶点内多态的筛选及功能分析 中文摘要 I 中文摘要 目的： 筛选肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）相关基因中 miRNA 结合靶 点内的基因多态并验证其与 HCC 发生的关联性进而探讨其中的具体分子机制。 方法： （1）利用生物信息学方法结合文献报道筛选 HCC 相关基因，并在 HCC 相关 基因 3UTRs 或 5UTRs 中预测目前人类已知
2、miRNA 的结合靶点， 然后在预测靶点 内筛出候选多态。 （2）基于第一步预测结果，采用病例对照研究方法，PCR 扩增 结合聚丙烯胺凝胶电泳技术对部分候选多态进行基因分型，Logistic 统计分析基因 位点与 HCC 的关联性。 （3）对发现的阳性关联基因多态位点，利用生物信息学的 方法预测该位点可能结合的 miRNA；采用定点突变和分子克隆技术，构建不同基 因型荧光素酶表达载体，与特定 miRNA 共转染人肝癌细胞系（HepG2 和 SMCC7721） ，采用双荧光素酶报告系统对荧光素酶表达量进行检测。 （4）采用 Real-time RT-PCR 方法， 分析阳性关联位点不同基因型的肝
3、癌组织样本目的基因的 表达水平。 结果： （1） 利用生物信息学方法结合文献报道筛选出HCC相关基因105个， 并在HCC 相关基因3UTRs或5UTRs中已知miRNA结合靶点内筛出16个候选多态（含SNPs和 插入缺失多态） 。 （2）我们从16个候选多态中选取了两个插入缺失多态进行病例对 照研究，分别是位于IL1A-3UTR的rs3783553（“TTCA” 4bp插入缺失）和位于 VEGF-5UTR的rs35569394（“TCCCACTCTTCCCACAGG”18bp插入缺失）。基因 分型结果显示，rs3783553和rs35569394均具有较好多态性，其在对照样本中最低 等位基因
4、频率分别为0.385和0.255。两位点在对照样本中的等位基因频率分布均符 合Hardy-weinberg平衡。卡方检验显示rs3783553的基因型和等位基因频率在HCC 组和对照组均存在显著性差异。用Logistic回归分析校正年龄、性别、吸烟、饮酒 中文摘要 肝细胞肝癌相关基因中 miRNA 结合靶点内多态的筛选及功能分析 II 及HBV感染因素后发现，与4N Ins/4N Del和4N Del/4N Del相比，携带有4N Ins/4N Ins的个体HCC易感性明显降低 （OR=0.30， 95%CI： 0.17-0.54） ， 趋势检验P值0.05） ，用 Logistic 回归分析
5、校正年龄、 性别、 吸烟、 饮酒及 HBV 感染因素后发现， rs35569394 位点等位基因及基因型与 HCC 易感性无明显关联性 （OR=0.94， 95CI： 0.55-1.91； OR=1.03，95CI：0.79-1.41，P0.05） 。 考虑到 HBV 感染与 HCC 发生的密切关系， 针对 rs3783553 多态， 我们对 HBV 进行了分层分析。经年龄、性别、吸烟、饮酒因素校正后，分析结果显示，分层 后插入型等位基因的保护作用仍能体现，但在 HBV 阳性的患者中更为突出。该结 果提示，rs3783553 多态可能在 HBV 感染的免疫调节过程中发挥作用。 表1-6 病例对
6、照样本中两位点基因型及等位基因频率分布与肝癌易感性的关联分析 Table 1-6. Genotype and allele frequencies of the two loci among cases and controls, and risk of HCC Polymorhisms Genotype Cases, n (%) Control, n (%)OR (95%CI)a P-value rs3783553 4N Del/4N Del 191 47.4 15836.4 1.00 (Reference) 4N Ins/4N Del 190 47.2 21850.2 0.70(0.51-
7、0.94) 0.0211 4N Ins/4N Ins 22 5.5 58 13.4 0.30(0.17-0.54) 0.001 Ptrend 0.001 4N Del 572 71.0 53461.5 1.00 (Reference) 4N Ins 234 29.0 33438.5 0.65(0.53-0.81) 0.001 rs35569394 18N Del/18NDel 118 57.3 16855.6 1.00 (Reference) 18N Ins/18N Del 73 35.4 114 37.7 0.90(0.61-1.37) 0.62 18N Ins/18N Ins 15 7.3
8、 20 6.6 1.06(0.54-2.25) 0.86 Ptrend 0.87 18N Del 309 75.0 45074.5 1.00 (Reference) 18N Ins 103 25.0 15425.5 0.97(0.72-1.31) 0.86 a 用 Logistic 回归分析校正年龄、性别、吸烟、饮酒及 HBV 感染因素 肝细胞肝癌相关基因中 miRNA 结合靶点内多态的筛选及功能分析 第一部分 21 表 1-7 rs3783553 位点与 HCC 易感性的分层分析 Table 1-7. Stratification analysis based on HBV infectio
9、n status of rs3783553 HBsAg Genotype Cases, n (%) Control, n (%) OR(95%CI)a Positive 4N Del/4N Del 139 48.6 8 20.0 1.00(Reference) 4N Ins/4N Del 130 45.5 24 60.0 0.31(0.13-0.71) 4N Ins/4N Ins 17 5.9 8 20.0 0.12(0.04-0.36) Ptrend P0.001 Negative 4N Del/4N Del 52 44.4 150 38.1 1.00(Reference) 4N Ins/4
10、N Del 60 51.3 194 49.2 0.88(0.57-1.36) 4N Ins/4N Ins 5 4.3 50 12.7 0.29(0.11-0.77) Ptrend P=0.0296 a用 Logistic 回归分析校正年龄、性别、吸烟、饮酒及 HBV 感染因素 第一部分 肝细胞肝癌相关基因中 miRNA 结合靶点内多态的筛选及功能分析 22 小 结 本部分首先利用生物信息学结合文献检索方法筛选出了 105 个 HCC 相关的候 选基因， 在这些候选基因的 3UTRs 或 5UTRs 内预测目前人类已知的 miRNA 结合 靶点，然后在预测靶点内筛出 16 个候选多态位点。我们从
11、中分别选取了位于 IL1A-3UTR 的 rs3783553（“TTCA”插入缺失）和 VEGF-5UTR 的 rs35569394 （“TCCCACTCTTCCCACAGG” 插入缺失）两个插入缺失（Indel）多态位点，在 HCC 患者与正常对照人群中对上述两位点进行病例对照研究。分型结果显示，我 们选取的两个 Indel 位点具有较好多态性，对照样本中最小等位基因频率分别为 0.385 和 0.255。两位点在对照样本中的等位基因频率分布均符合 Hardy-weinberg 平衡。卡方检验显示 rs3783553 的基因型和等位基因频率在 HCC 组和对照组均存 在显著性差异。用 Log
12、istic 回归分析校正年龄、性别、吸烟、饮酒及 HBV 感染因 素后发现，与 4N Ins/4N Del 和 4N Del/4N Del 相比，携带有 4N Ins/4N Ins 的个体 HCC 易感性明显降低（OR=0.30，95%CI：0.17-0.54） ，趋势检验 P 值0.001。HBV 分层分析后显示，分层后插入型等位基因的保护作用仍能体现，但在 HBV 阳性的 患者中更为突出。该结果提示，rs3783553 多态可能在 HBV 感染的免疫调节过程 中发挥作用。而 rs35569394 经上述分析后发现与 HCC 易感性不存在显著性关联， 趋势检验 P 值=0.87。 肝细胞肝癌
13、相关基因中 miRNA 结合靶点内多态的筛选及功能分析 第二部分 23 第二部分 IL1A 基因 3UTR rs3783553 不同基因型转录 调控功能检测 发现与疾病存在关联性的多态是本研究的第一步，更重要的是认识这些多态 如何改变基因及细胞的功能，从而进一步阐明遗传因素在 HCC 发生过程中的具体 分子机制。我们假设 IL1A 基因 3UTR rs3783553 的存在影响了 miRNA 与 IL1A 基 因 3UTR 的结合，从而调控 IL1A 基因的转录及表达。因此我们将构建包含 4N Ins 和 4N Del 两种等位基因的荧光素酶表达载体，通过与特定 miRNA 共转染肝癌细 胞进
14、一步研究不同等位基因对荧光素酶活性的影响。 材料与方法 1 材料 1.1 实验细胞、菌株和质粒实验细胞、菌株和质粒 人肝癌细胞株（HepG2）由中山大学肿瘤防治中心郑利民教授馈赠；人肝癌细 胞株（SMMC7721）购买自中科院细胞库。所有的细胞株均置于含有 10%胎牛血 清的 DMEM 培养基中培养； 大肠杆菌 DH50 感受态细胞，由本室保存； 转染试剂脂质体 Lipofectamine2000，购自 Invitrogen 公司； pGEM-T Vector，购自 Promega 公司； pRL-SV40 Vector，购自 Promega 公司； pGL3-Basic Luciferase
15、 Reporter Vectors，购自 Promega 公司； 1.2 试剂及耗材试剂及耗材 胎牛血清，购自 Invitrogen 公司，批号：16000-044； DMEM 培养基，购自 Invitrogen 公司，批号： 12800017； 限制性内切酶 XbaI，购自 Promega 公司，批号：R6181； 限制性内切酶 BamHI，购自 Promega 公司，批号：R6021； PrimeSTARHS DNA Polymerase，购自 TaKaRa 公司，批号：DR010A ； 第二部分 肝细胞肝癌相关基因中 miRNA 结合靶点内多态的筛选及功能分析 24 T4 DNA 连接酶
16、，购自 Promega 公司，批号：M1801； 质粒小量抽提试剂盒，购自 Axygen 公司，批号：AP-MN-P-50； DNA 凝胶回收试剂盒，购自 Axygen 公司，批号：AP-GX-50； QuickChange XL site-directed mutagenesis kit，购自 Stratagene 公司，批号： 200516； Dual-Luciferase assay system，购自 Promega 公司，批号： E1910； pre-miR-122，pre-miR-378，Negative Control，购自 Ambion 公司，批号： AM17103； DNA Marker，购自 Fermentas 公司，批号：SM0633； 引物，购自上海生工； 其余试剂均为国产分析纯； 主要试剂配制 （见附录 1） ； 1.3 仪器仪器
