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1、上海交通大学 硕士学位论文 肝癌选择性溶瘤腺病毒的构建及其体外抑瘤作用 姓名：傅强 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：黄倩 20090501 上海交通大学硕士学位论文 肝癌选择性溶瘤腺病毒的构建及其体外抑瘤作用 肝癌选择性溶瘤腺病毒的构建及其体外抑瘤作用 摘 要 摘 要 研究目的：研究目的：构建携带自杀基因、能够选择性在肝癌细胞中复制、 并杀伤肝癌细胞的新型腺病毒载体， 研究该载体在肝癌细胞及正常肝 细胞中的复制与杀伤能力， 以及联合应用前药丙氧鸟苷 （gancyclovir， GCV）后对肝癌细胞杀伤效果的改善情况，为肝癌基因治疗提供一 种新的载体和工具。 研究方法：
2、研究方法：以肝细胞癌HepG2细胞基因组DNA为模版，PCR扩增 甲胎蛋白基因（AFP）5端300bp核心启动子顺序（AFPp） ，以及被截 短了的但包含两个亚区的800bp增强子顺序（AFPe） 。以增强型绿色 荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）及萤火虫荧光 蛋白（Luciferase，luc）的融合基因（EGFPluc）作为报告基因，构 建表达质粒pAFPp-EGFPluc和pAFPe-AFPp-EGFPluc，通过检测报告 基因EGFP和Luciferase的表达鉴定AFPp和AFPe的活性，在质粒水平 上检验含有启动子和增强子顺序
3、的人工启动子AFPe-AFPp （以下简称 AFPep） 是否比单独的AFPp有更高的活性和特异性。 分别构建由AFPp 或 AFPep 调 控 E1A 表 达 的 穿 梭 质 粒 pDC311-AFPp-E1A 、 pDC311-AFPep-E1A以及由AFPep调控E1A表达并携带自杀基因TK的 穿梭质粒pDC311-AFPep-E1A-CMV-TK，而后利用AdMax腺病毒包装 系 统 分 别 包 装 出 腺 病 毒 Ad.AFPp-E1A 、 Ad.AFPep-E1A 和 I 上海交通大学硕士学位论文 Ad.AFPep-E1A-CMV-TK。利用Western blotting、病毒增
4、殖测试、细 胞病变、细胞活力等鉴定并比较Ad.AFPp-E1A和Ad.AFPep-E1A在选 择性复制能力和溶瘤作用方面的差异， 在病毒水平上检验AFPep调控 E1A的重组腺病毒是否比AFPp调控E1A的重组腺病毒有更好的选择 性；利用Western blotting、病毒增殖测试、细胞病变、病毒联合前药 GCV 对 肝 癌 细 胞 的 杀 伤 实 验 等 鉴 定 重 组 腺 病 毒 Ad.AFPep-E1A-CMV-TK的选择性复制能力和溶瘤作用。 研究结果：研究结果： 1、质粒水平上AFPp与AFPep的活性和特异性的鉴定与比较 通过检测报告基因EGFP和Luciferase的表达，发现
5、AFPp和AFPep在肝 癌细胞均具有一定的活性和特异性，其中AFPep的活性和特异性更为 明显。 2、病毒水平上Ad.AFPp-E1A与Ad.AFPep-E1A的比较 （1）Ad.AFPp-E1A、Ad.AFPep-E1A感染人肝癌细胞（HepG2）以及 正常肝细胞（chang liver 细胞）后，Western bloting检测ElA表达，检 测 结 果 表 明 在 AFP 阳 性 的 HepG2 肝 癌 细 胞 中 Ad.AFPp-E1A 、 Ad.AFPep-E1A均有ElA蛋白表达，而在AFP阴性的chang liver正常肝 细胞中，Ad.AFPp-E1A、Ad.AFPep-E
6、1A均没有检测到ElA蛋白表达； 在感染了Ad.AFPep-E1A的HepG2细胞中E1A的表达量明显高于感染 了Ad.AFPp-E1A的HepG2细胞。 （2）Ad.AFPp-E1A、Ad.AFPep-E1A感染人肝癌细胞（HepG2和 Hep3B） ，人非小细胞肺癌细胞（NCIH460） ，以及正常肝细胞（chang II 上海交通大学硕士学位论文 liver细胞）后，通过病毒增殖测试实验发现Ad.AFPp-E1A及Ad. AFPep-E1A在人肝癌HepG2、Hep3B细胞中的复制能力明显高于在非 肝癌来源的肿瘤细胞（NCIH460）及正常肝细胞（chang liver 细胞） 中的复制
7、能力。 （3）通过细胞病变实验发现Ad.AFPp-E1A和Ad.AFPep-E1A对AFP阳 性细胞均具有一定的溶瘤作用，其中后者的溶瘤作用更为明显。 （4） 通过细胞杀伤实验发现， 感染了Ad.AFPp-E1A的HepG2、 Hep3B 细胞的存活率分别为(54.237.13)%、(61.1812.63)%；而感染了 Ad.AFPep-E1A 后 的 HepG2 、 Hep3B 细 胞 的 存 活 率 分 别 为 (26.655.43)%、(24.493.31)%。与正常肝细胞（chang liver 细胞）对 照相比，感染了Ad.AFPp-E1A、Ad.AFPep-E1A的肝癌细胞其生长明
8、 显受到抑制，其中Ad.AFPep-E1A抑制细胞生长的作用更为明显。 3、重组腺病毒AFPep-E1A-CMV-TK联合前药GCV对肝癌细胞的杀伤 作用 （1）通过Western blotting、病毒增殖测试证明带有自杀基因TK的腺 病毒载体Ad. AFPep-E1A-CMV-TK具有在AFP阳性细胞中选择性复 制的能力，通过细胞病变实验证明该病毒自身具有一定的溶瘤作用。 （2）Ad. AFPep-E1A-CMV-TK联合GCV后对AFP阳性的HepG2和 Hep3B肝癌细胞的杀伤作用增强。以非复制型腺病毒Ad.GFP作为对 照， 单独使用Ad. AFPep-E1A-CMV-TK、 以及A
9、d.AFPep-E1A-CMV-TK 联合GCV后HepG2、Hep3B细胞的存活率如下：HepG2细胞分别为 (99.115.94)%、(25.561.23)%、(10.351.07)%；Hep3B细胞分别为 III 上海交通大学硕士学位论文 (97.295.32)%、(24.547.30)%、(15.495.80)%。 以上结果表明GCV可以增强Ad. AFPep-E1A-CMV-TK的细胞杀 伤效果。感染Ad.AFPep-E1A-CMV-TK并加前药GCV后，AFP阳性的 肝癌细胞HepG2和Hep3B的生长明显受到抑制。 研究结论：研究结论：本研究采用AFP基因启动子及截短了的AFP基
10、因增强 子顺序作为调控元件，调控腺病毒复制所需的早期基因E1A表达，成 功构建了肝癌选择性复制型腺病毒载体。 与其他研究工作相比， 我们 所构建的AFP人工启动子具有良好的肝癌选择性， 并为腺病毒载体插 入治疗基因提供了更多的空间； 本研究不拘泥于单一的病毒疗法， 还 在复制型腺病毒中加入了TK自杀基因，有机结合了复制型腺病毒的 溶瘤作用与自杀基因的基因治疗作用， 这种协同效应， 使该病毒具有 更好的特异性和杀伤效果，为肝癌的治疗提供了新的载体和方法。 关键词：条件复制型腺病毒载体，甲胎蛋白基因启动子，甲胎蛋白基 因增强子，HSV-1 TK 基因，病毒基因疗法 IV 上海交通大学硕士学位论文
11、CONSTRUCTION OF HEPATOCARCINOMA-SELECTIVE REPLICATION COMPETENT ADENOVIRAL VECTORS AND ITS EFFECT ON HEPATOCARCINOMA IN VITRO ABSTRACT Purpose: Firstly, Construct two Conditionally Replication-Competent Adenoviral Vectors(CRAs) driven by alpha fetoprotein(AFP) 300bp promoter and 300bp promoter-AFP 8
12、00bp enhancer respectively. And find a better CRA vector for liver cancer targeting therapy. Secondly, To construct novel conditionally replicative adenovirus (CRA) that is specific for AFP-positive cancer cells and expresses the Herpes simplex virus type-1 thymidine kinase (HSV-1TK) gene that can m
13、ake the tumors sensitive to GCV. To observe the ability of conditional replication of this viral vector and to study the function of this viral vector for liver cancer therapy in vitro when combine with GCV/TK system. Method: The minimal essential DNA fragment of the AFP gene promoter and enhancer w
14、as amplified through PCR from the genome of HepG2 cells. Constructed the plasmid pAFPp-EGFPluc and pAFPep-EGFPluc to evaluate the activity of the AFP promoter and V 上海交通大学硕士学位论文 enhancer by the way of Flow cytometry and detecting fluorescence. Then constructed the shuttle plasmid pDC311-AFPp-E1A and
15、 pDC311-AFPep-E1A and constructed the conditionally replicative adnovirus (CRAs)Ad.AFPp-E1A and Ad.AFPep-E1A . The ability of conditional replication was detected and comparison by western blot, virus multiplication test and CPE. At last measured the oncolytic efficacy of these two virus in AFP posi
16、tive cells like HepG2 and Hep3B. Then constructed Ad.AFPep-E1A-CMV-TK.The ability of conditional replication and the oncolytic efficacy of this virus was detected by western blot, virus multiplication test and CPE, then checked the function of this viral vector for liver cancer therapy in vitro when combine with GCV/TK system. Results: 1. we found that the AFP promoter and AFP enhancer-promoter both had the activity and specificity checked by the way of Flow cytometry and detecting
