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1、响应面法优化低乳糖奶水解工艺徐晨收稿日期：2011-03-07基金资助：北京市科技计划（D10110504600000）作者简介：徐晨（1986-），女，硕士，研究方向为食品发酵工程。.2，杜鉴3，陈历俊2，石维忱4（1.大连工业大学，大连116034；2.北京三元食品股份有限公司,北京100085；3.中国食品添加剂和配料协会,北京100020；4.中国生物发酵产业协会，北京100037）摘 要：牛奶及乳制品营养丰富，容易消化吸收，人称“白色血液”，是最理想的天然食品。近年来我国乳业发展迅速，但与世界平均水平仍存在巨大的差距，制约我国乳业发展的一个重要原因就是乳糖不耐症。利用-半乳糖苷酶对牛
2、奶进行水解可生成易被人体吸收的葡萄糖、半乳糖及“双歧因子”低聚半乳糖，不仅能解决乳糖不耐症问题，还能增加牛奶的营养价值。本文在单因素初步试验的基础上，以低聚半乳糖合成率为响应指标，通过响应分析法对低乳糖水解工艺进行优化。结果表明，当反应温度为45.3、加酶量为2.5ml及反应时间为69.7min时，低聚半乳糖得率达到最大值6.15%。通过乳果糖试剂盒测定水解后低乳糖奶中乳果糖含量，平均含量为158.17mg/L。关键词：低聚半乳糖；-半乳糖苷酶；响应面法；低乳糖奶Optimization of low-lactose milk manufacture using response surfac
3、e methodologyXU Chen1,2, CHEN Li-jun2, SHI Wei-chen3( 1. Dalian Polytechnic University, Dalian 116034; 2. Beijing Sanyuan Foods Co., Ltd, Beijing 100085; 3. China Fermentation Industry Association, Beijing 100037 )Abstract：Nutrient-rich milk and dairy products, easy digestion and absorption, known a
4、s white blood , is the best natural food. China dairy industry has developed rapidly in recent years, but there is still a huge gap in average level compared to the world. And lactose intolerance is one of the most important reason for restricting the development of China dairy industry. Using -gala
5、ctosidase hydrolysis of milk can generate glucose, galactose and the bifidus factor galactooligosaccharide, which Not only solve the problem of lactose intolerance, but also increase the nutritional value of milk.On the basis of single factor experiment, the best hydrolysis technique parameter were
6、acquired by response analysis in which the galactooligosaccharide synthesis rate was the main indicator. The results showed that when the reaction temperature was 45.3 , enzyme concentration was 2.5ml and reaction time was 69.7min, the maximum galactooligosaccharide yield was 6.15%. The lactulose co
7、ntent in low-lactose milk was 158.17mg/L determined by lactulose kit.Key words: galactooligosaccharide; -galactosidase; response surface methodology; low-lactose milk0 引言牛奶是迄今为止人们从自然界中所能够获得的最接近完美的一种食物，它不仅能够给人们提供身体及大脑生长发育所需要的优质的动物蛋白质、乳脂肪和维生素等，而且还是人体补钙的最佳选择1，但是乳糖不耐症限制了部分人群无法享用牛奶这一宝贵资源。利用-半乳糖苷酶对牛奶进行水解可
8、生成易被人体吸收的葡萄糖和半乳糖，之后部分半乳糖在-半乳糖苷酶作用下合成少量功能性低聚糖，例如低聚半乳糖（Galactooligosaccharide, 简称GOS）及乳果糖2（lactulose）等。GOS具有良好的双歧杆菌增殖活性3，可抑制病原菌、有毒物代谢和有害酶的产生，具有防止腹泻、便秘，降低血清胆固醇，改善矿物吸收4等作用。因此，本实验以GOS合成率为主要指标，在单因素试验基础上进行响应面试验，确定低乳糖奶水解的最佳工艺，为低乳糖奶工业化生产提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料脱脂奶，北京三元食品股份有限公司华冠分公司提供；乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis
9、 2.1494）-半乳糖苷酶粗酶液：实验室自制；麦芽汁培养基：北京青岛金五星啤酒厂提供；1.2 仪器与试剂冷冻离心机：sigma公司；Cintra 20分光光度计：澳大利亚GBC公司；高效液相色谱：HPLC-10Avp，岛津公司；pH检测计：Orion 3 star, 美国Thermo Electron公司；循环式精密恒温水浴锅：Polystatccl, 德国peter Huber公司；隔膜过滤器：1L，天津市津腾实验设备有限公司。乳糖、半乳糖及葡萄糖标品为色谱纯，sigma公司；GOS为工业化糖浆，分析级。乙腈为色谱纯，Fisher Scientific公司；乳果糖试剂盒：Megazyme
10、International Irelan Ltd., 爱尔兰。1.3 实验方法1.3.1 -半乳糖苷酶的制备 采用超声破碎-离心法制备-半乳糖苷酶粗酶液并测定其比活力5。1.3.2 -半乳糖苷酶作用于脱脂奶的水解反应 原料奶离心脱脂后巴氏杀菌，冷却后加入100ml至250ml锥形瓶中，再加入适量的-半乳糖苷酶粗酶液，在一定温度下振荡反应（100r/min），定时取样1ml，沸水浴灭酶，稀释10倍后15000r/min离心15min，上清经0.22m双膜过滤器过滤后进行HPLC分析。1.3.3 高效液相色谱（HPLC）分析-半乳糖苷酶水解产物高效液相色谱仪：岛津液相色谱仪；RID-10A示差检测
11、器；Aminex HPX-87C分离柱（300mm7.8mm），分析软件为Class-VP 6.0。流动相：超纯水；流速：0.5ml/min；进样量：10l；柱温：75。根据色谱峰位置（出峰时间）和峰面积大小，采用归一化法计算葡萄糖、半乳糖、乳糖及GOS的含量。1.3.4 乳果糖含量的测定取1ml在一定条件下水解后的低乳糖奶，沸水浴灭酶，稀释10倍后使用乳果糖试剂盒测定。2 结果与分析2.1 HPLC法测定水解产物分离情况图1 乳糖酶水解后脱脂奶中的糖组分Fig.1 Lactase hydrolysis of sugar components in skim milk-半乳糖苷酶水解脱脂奶中的
12、部分乳糖后生成葡萄糖、半乳糖及GOS，如图1所示，四种糖通过RID-10A示差检测器检测，在Aminex HPX-87C分离柱（300mm7.8mm），流动相为超纯水，流速为0.5ml/min，进样量为10l，柱温为75的条件下达到完全分离。2.2 HPLC法测定乳糖标准曲线分别选取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/ml乳糖标准溶液绘制标准曲线，如图2所示，标准曲线的方程为y=157003x-1221.3，其中乳糖标准品浓度与峰面积的相关系数r2=0.9999。图2 乳糖标准曲线Fig.2 Calibration curve using lactose as the st
13、andard2.3 HPLC法测定乳糖的回收率 通过5次平行试验，测定的HPLC法乳糖回收率分别为99.37%、99.90%、96.33%、100.96%、96.87%，回收率较好，液相法测定糖组分方法误差较小。2.4 低乳糖奶水解单因素试验2.4.1 反应温度对GOS合成量的影响在反应时间为60min，加酶量为3.0ml的条件下，测定不同温度（3050）对-半乳糖苷酶水解脱脂奶后糖组分变化的影响，结果如图3所示：图3 反应温度对GOS合成量的影响Fig.3 Effects of reaction temperature on the GOS yield由图可知，随着反应温度的逐渐升高，-半乳
14、糖苷酶水解活力不断增加，乳糖含量迅速下降，单糖含量逐渐上升，当温度为45时，-半乳糖苷酶水解活力达到最大值，此时GOS含量也为最大值；温度继续升高，GOS含量略微下降，-半乳糖苷酶活力直线下降，可能温度过高，导致部分酶失活。综上所述，试验选择45为脱脂奶水解温度。2.4.2 不同加酶量对GOS合成量的影响在反应时间为60min，反应温度为45的条件下，测定不同加酶量（2.04.0ml）对-半乳糖苷酶水解脱脂奶后糖组分变化的影响，结果如图4所示：图4 不同加酶量对GOS合成量的影响Fig.4 Effects of enzyme concentration on the GOS yield 如图所
15、示，随着加酶量的增加，脱脂奶中的乳糖水解率不断增加，GOS含量在加酶量为2.5ml时达到最大，继续增加-半乳糖苷酶含量，GOS含量略微下降，故确定反应加酶量为2.5ml。2.4.3 反应时间对GOS合成量的影响在反应温度为45，加酶量为2.5ml的条件下，测定不同反应时间（4080min）对-半乳糖苷酶水解脱脂奶后糖组分变化的影响，结果如图5所示：图5 反应时间对GOS合成量的影响Fig.5 Effects of reaction time on the GOS yield随着反应时间的不断增加，乳糖水解率不断增加，GOS含量也逐渐升高，当反应时间为70min时，GOS合成量达到最大，继续延长反应时间，乳糖水解率继续增加，GOS含量略微下降，可能部分GOS被-半乳糖苷酶水解，综上所述，试验选取70min为反应时间。2.5 响应面法对低乳糖奶水解条件的优化在单因素试验的基础上，确定Box-Behnken设计的自变量，以GOS含量为响应值，运用Minitab15数据处理软件进行响应曲面分析( response surface analysis, RSA)，对低乳糖奶水解条件进行优化。响应面设计因素水平设计见表1。表1 响应面设计因素与水平Tab. 1 Level of factors chosen for the trials因素水平-1
