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1、 2 脐血造血干细胞分离方法的实验研究 2.1 引言 2.1.1 目的 优化脐血造血干细胞/祖细胞的分离方法 2.1.2 方法 脐血按体积比 1：5 与含有树脂海绵筛(筛孔直径约 12um )的 6%羟乙基淀粉混合, 静置 60m in, 提取界面有核细胞。倒 置显微镜下计数有核细胞数, 集落培养记数 CFU- GM 数, 流式细胞 仪检测 CD34+ 细胞数, 并与按照标准的羟乙基淀粉沉淀法和淋巴细 胞分离液密度梯度离心法分离的脐血相对照。 2.2 材料与方法 2.2.1 主要试剂和仪器 超净工作台 苏州净化设备厂 SW C J 2FD 倒置相差显微镜、 荧光显微镜 日本 O lympus
2、产品 高速离心机 湖南星科医学仪器厂 BA 61 型电子天平 Sarto rius 公司, 德国。 淋巴细胞分离液 天津 TBD 公司 羟乙基淀粉 ( S igm a ), RPM I21640 ( GIB2CO ) , 抗 CD3 、抗 CD14、抗 CD34 单克隆抗体及 FITC 标记的抗鼠 IgG 荧光抗体 ( Pharm ingen) , Epo 及GM2CSF (北京邦定生物医学公司), 树脂海 绵(德国产分装) ,胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)。 2.2.2 脐血来源 正常足月剖腹产或足月正常产乙肝病毒检测阴性 孕妇的脐带血, 征得孕妇及家属的同意。 2.2.3 脐带血
3、的收集和单个核细胞的分离； 无菌条件下取正常足 月剖腹产或足月正常产乙肝病毒检测阴性孕妇的脐带血 50 80m ,l 放于含 CPDA1 复合抗凝剂的采血袋中, 4 保存, 所有样本均在采 集后 12h 内进行分离; 将 1 份脐血分成 3 份。每份用生理盐水 1：1 稀释后分别用于以下实验。 2.2.3.1 淋巴细胞分离液法 将稀释的白细胞沿管壁缓慢加入含 Fico llHypaque 人淋巴细胞分离液上层(两者比例为 1： 1) , 其相对密度为 1.077g /L,进行梯度离心( 2300r /m in x 25m in), 然后缓慢吸取中间 交界面细胞悬液至另一离心管, 获得单个核细胞
4、悬液, 用 PBS 缓冲 液洗涤2 次, 再悬于10m l1640培养液中, 计数NC 数, 以苔盼兰染 色法测定每份标本的细胞活力( 95% 则用于以下实验)。 2.2.3.2 6%羟乙基淀粉(HES)自然沉降法 按 1：5 的比例将 6% HES 和稀释的 UCB 混合, 室温静置 60m in, 收集上层富含白细胞 的血浆层, 细胞离心收集单个核细胞( 800r/m in x10m in), 将收集的 细胞用 PBS 洗涤 2 次, 悬于 10m l 1640 培养液中, 测定有核细胞 (NC)数及其活力。 2.2.3.3 6%羟乙基淀粉(HES) 自然沉降改良法按 1： 5 的比例将
5、6% HES 和稀释的 UCB 混合后通过树脂海绵筛(筛孔大下约 12um )过滤, 然后室温静置60m in, 收集上层富含白细胞的血浆层, 将收集的细胞 同法洗涤, 悬于 10m l 1640 培液中, 测定 NC 数及其活力。 2.2.4 计算 NC 产率 分离前后计数 NC 总数, 两者相除即为 NC 产率。 2.2.5 细胞活力检测 用台盼蓝拒染法进行检测。 2.2.6 体外集落培养 CFU - GM 的测定: 采用半固体琼脂培养 法。1m l 培养体系中含 100000 个有核细胞, 0.3% 琼脂, 20% 胎牛 血清, GM CSF 20ng /ml Epo 2U /m l。混
6、匀后加于 24 孔板, 每 组设 3 个复孔。置 5% CO2 培养箱中培养 7d, 于倒置显微镜下计数 集落, 以大于 40 个细胞的细胞团为一个集落。 2.2.7 细胞表型的测定 将分离获得的 NC 先后与抗 CD 单克隆 抗体和 FITC 标记的抗鼠 IgG 作用后, 用流式细胞仪( FACScan) 测 定, 未经分离的 UCB 直接进行细胞表型测定, 用作对照。 2.2.8 统计学方法 实验数据经 SPSS 10. 0 forw indow s xp 软 件处理, 统计方法采用 ANOVA 和 SNK 两两比较分析。所有数据均 以( x s )表示。 2.3 结果 2.3.1 NC
7、密度的比较 本实验共收集 UCB25 份,平均血量每份 ( 60 25) m l 脐全血 NC 密度为( 1.21 0. 70) x10000000/m l。将 3 种 NC 分离法分离得的 NC 置等体积 1640 培养液中, 测得细胞 活力均超过 95% ( NC6%羟乙基淀粉中, 室温静置 1、2、4、8、12、 24h, 其活力仍 95% ) , 但NC 密度以6%羟乙基淀粉沉淀改良法最 高, 6% 羟乙基淀粉自然沉降法次之, F ico ll 分层法最低, 各组间有 显著差异( P 0. 01) , 见表 1。 2.3.2 CFU - GM 数的比较实验任选 15 份标本,以 3 种
8、方法分离获 得 NC, 然后经 14 d 半固体琼脂培养, CFU - GM 数个体差异较大, 但以 6% 羟乙基淀粉沉淀改良法最高, 与另两法相比有显著差异( P 0.05) , 见表 2。 2.3.3 NC 中不同表型细胞的比较 对随机选取的 10 例 UCB 中 NC 表型测定发现, 6% 羟乙基淀粉沉淀改良法所得的 CD34+ 细胞较另 两法为高, 有显著差异( P 0. 05 ), 该法所得的 CD3+ 及 CD14+ 细胞也明显增多( P 0. 05)。 2.4 讨论讨论 据估计人胎盘及脐带的总血量可超过 200m ,l 但实际采集时回收血差 异较大, 本实验采集血量平均每份为(
9、80 15) m,l 但已够一位成人 患者移植干细胞的需要量。 2.4.1 NC 数和集落数数和集落数 经不同分离方法比较后显示, 3 种方法均 可使红细胞减少至 1% 以下, NC 活力保持在 95%以上, 而其中 6% HES沉降改良法所收集到的NC 数, 明显较F icoll分层法及6%HES 自然沉降法为高, 与分离前数相比, 得率超过 72%。 F ico ll 分层法的 NC 和 CD34+ 细胞得率偏低, 可能是因为该法仅富集单一比重的单 个核细胞, 而不同分化阶段的 CD34+ 细胞比重不一, 而且由于离心 力的不同可能使部分细胞沉降入红细胞部分或者混在血浆部分, 从 而造成部
10、分干细胞丢失。6% HES 沉降改良法和 6% 羟乙基淀粉自 然沉降法主要是去除 UCB 中的红细胞, 因而 NC 和 CD34+ 细胞得 率均较高, 由于 6% HES 沉降改良法只是加入了树脂海绵筛而没有 影响其他因素,从而更容易使红细胞和单个核细胞分离, 所 6% HES 沉降改良法效果更佳。 NC 经半固体琼脂培养和流式细胞仪测定也发 现 6% HES 沉降改良法能获得更多 CFU - GM 集落数及 CD34+ 细 胞, 表明该法能阻止单个核细胞的沉降, 利于从 UCB 中富集更多的 造血干/祖细胞。 2.4.2 NC 表型测定表型测定 6% HES 沉降改良法所分离的 NC 中 C
11、D 3+ 及 CD 14+ 细胞数也明显较高,虽然 T 细胞( CD3+ 细胞) 及单核细胞( CD14+ 细胞)数直接与移植后的排斥反应的发生 相关, 但由于脐血 T 细胞的幼稚性及低免疫活性, 临床脐血移 植后排斥反应发病率和严重程度均明显较低。 分离脐血单个核细胞的关键是尽可能地回收脐血中的造血干/ 祖细胞。 目前脐血单个核细胞分离方法主要有, 6% 羟乙基淀粉 沉降法、Fico ll 分层法、3. 0%明胶分离法、甲基纤维素沉降法 等。不同方法对脐血单个核细胞的回收率各家报道不一。由于 许多国家未批准明胶和甲基纤维素用于临床。在脐血单个核细 胞分离中较少使用。由于其实用价值不高, 故本
12、实验没有做后 两种分离方法的对比。 研究发现, 由淋巴细胞分离液法分离的脐血, 单个核细胞等丢失较6% HES 自然沉降法及其改良法要多, 而 且淋巴细胞分离液法为开放操作, 增加了细胞污染的几率。而 6% HES 自然沉降法及其改良法则为密闭操作, 污染的机会明 显减少。通过本实验, 我们体会到 6% HES 沉降改良法操作较 Ficoll 分层法简便、不易污染, 沉降速度及途径较用 6% HES 沉降法一样, 但是效果却明显优于 6% HES 沉降法。而且, 6% HES 沉降改良法明显杂质含量要较前两种为少, 这样也减少了 移植后机体的反应, 提高移植治疗效果。 由此, 我们完全可以认 为 6% HES 沉降改良法不失为一种简便、 高效的 UCB 干/祖细 胞分离法。
