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1、第二军医大学 硕士学位论文 糖尿病大鼠心肌微血管的改变与PAI-1mRNA相关性研究 姓名：孙小毛 申请学位级别：硕士 专业：老年医学 指导教师：拓西平 20100501 摘要 背景：糖尿病( D i a b e t e sM e l l i t u s ，D M ) 及其慢性并发症已经严重威胁到人们的 健康。D M 常并发血管及血栓性疾病。血栓前状态分子标志物之一的纤溶活性指标一 纤溶酶原激活物抑伟物1 ( P l a s m i n o g e nA c t i v a t o rI n h i b t o rl ，P A l 1 ) 的变化与血栓形 成密切相关。P A l 1 是组织型纤
2、溶酶原激活物( t i s s u eP l a s m i n o g e nA c t i v a t o r ，t - P A ) 和 尿激酶型纤溶酶原激活物( u r i n eP l a s m i n o g e nA c t i v a t o r ，U P A ) 的特异性快速抑制剂。 t - P A P A I 一1 是调节纤溶系统生理功能的一对重要产物，他们之间的生理平衡对调节血 流畅通起到了重要作用。目前许多研究已经阐明了糖尿病大血管病变、糖尿病肾病 ( D N ) 、糖尿病性视网膜病变( D R ) 与P A l 一1 的密切相关性，而糖尿病心肌微血管病变 与P A l
3、 一1 关系尚未发现有关报道。流行病学研究显示：临床上一些糖尿病心绞痛的患 者，排除了患者以前有冠状动脉性心脏病或风湿性心脏病，并且排除年龄、血压、体 重和血清胆固醇等危险因素，冠脉造影也显示无明显异常，经过扩冠、活血化瘀、降 脂治疗后，症状明显缓解。其机制之一可能是糖尿病时微血管内皮损害及其炎性因子 共同促进了心肌组织P A l 1 m R N A 的表达，心肌微血管内P A l 1 水平增加，t - P A P A I l 调节失衡，局部纤溶活性受抑，血液呈现高凝状态，微血栓形成，最终导致微血管病 变。本研究通过建立糖尿病大鼠模型，观察糖尿病心肌微血管的改变与心肌组织 P A I l m
4、R N A 相关性，为临床上对糖尿病患者使用抗凝剂及糖尿病患者预防心血管疾 病提供实验依据。 目的：建立糖尿病大鼠模型，观察糖尿病对心肌微血管的影响，研究糖尿病心肌 微血管的改变与P A l l m R N A 相关性，并进一步探讨增龄是否对心肌微血管及 P A l 1 m R N A 表达有影响。 方法：1 将老龄及青年雄性S D 大鼠适应性喂养3 天后，分别随机分为老龄糖尿病 造模组、老龄对照组、青年糖尿病组、青年对照组共4 组，造模组以5 5 m g K g 剂量一次 性腹腔注射S T Z 液。对照组大鼠腹腔注射等量的柠檬酸盐缓冲液。各组喂养7 2 h 后于尾 尖部测空腹血糖。2 喂养8
5、 w 后，处死大鼠，取部分左心室组织做免疫组化；剩余部 分留做心肌组织P A I 一1m R N A 检测。3 采用E n V i s i o n 免疫组化法，C D 3 4 抗体检测心肌微 血管内皮细胞特异性抗原C D 3 4 。光学显微镜倍数：2 5 0 ，视野面积0 0 3 4 m m 2 ，每个 第二军医大学硕士学住论文 标本随机观N w 3 个视野，采用医学图像分析软件计数心肌微血管数目( 棕黄色圆形、椭 圆形或半椭圆形为一个微血管) 。3 R e a l T i m eP C R ( S Y B RG r e e nI ) 法检测各组心肌 组织P A I - 1m R N A 的表
6、达。 结果：1 造模7 2 h 后，青年糖尿病组空腹血糖值显著高于青年对照组( 2 0 31 + 2 6 4V S 4 9 6 + 0 5 0 ，P 3 0k g m 2 ) 分 别增加患静脉血栓危险性的1 7 倍和2 4 倍【5 。几项研究直接表明脂肪组织是P A l 1 的重 要来源。其中内脏脂肪堆积比皮下脂肪产生更多的血浆P A l 一1 。通过手术切除脂肪组 织和低脂饮食后，血浆P A l 1 水平明显降低。脂肪组织诱导P A l 1 基因表达增强的机制 尚不明确，目前研究仅表明脂肪组织通过炎性反应刺激P A I l 的表达，肥胖是一种慢 性低程度的炎性反应状态，急性反应期，脂肪组织中
7、脂肪细胞以自分泌或者远分泌的 方式释放促炎性细胞因子( I L 1 、I L 6 、T N F 0 【) 促进P A l 1 的表达1 5 2 1 。另一项研究表 明脂肪组织是通过分泌肿瘤坏死因子仅( T N F 0 【) ，刺激P A l 1 在脂肪细胞、血管平滑 肌细胞( V S M C s ) 等其他组织的表达。值得注意的是抑制T N F a 时也能抑制P A 1 的表 达，但是在给体瘦的动物注射T N F 0 【时，脂肪中的P A l 1 基因表达增强【5 3 】。这些研究 说明肥胖时P A l 一1 基因表达增强是多种细胞因子共同作用的结果，而不是脂肪组织直 接刺激P A l 1 基
8、因表达的增强。 临床上检测P A l 1 活性多采用底物发色法，其原理为过量的纤溶酶原活化剂( 如 t P A ) 加入到待测的血浆中，部分与血浆中的P A l 1 作用，形成无活性的复合物，剩 余的t P A 作用于纤溶酶原，使其转化为纤溶酶，后者可水解发色底物$ 2 2 5 1 ，释放出 P N A ，生色强度与P A l l 活性成反比。检测P A I 1 抗原时多采用双抗夹心法，其升高见 于高凝状态和血栓性疾病，减低见于原发性和继发性纤溶。这两种方法操作简单方便， 但并不能反应机体某个脏器的P A l 1 的表达。在动物研究方面，多采用免疫组化法观 察组织P A l 1 蛋白的表达。另
9、外目前许多实验通过研究糖尿病动物的肝脏、。肾脏、脂 肪细胞及血管内皮的P A l 一1 的m R N A 表达，从基因转录水平更能准确反应其相关性， 敏感性、特异性更甜5 4 】。 本研究显示造模8 W 后，各年龄段的糖尿病造模组心肌微血管数目与对照组相比 明显减少，同时相对应的各年龄段糖尿病造模组心肌组织P A l l m R N A 表达较对照组 相比明显升高，说明糖尿病心肌微血管病变与P A l 1 m R N A 表达有一定相关性。其机 第二军医大学硕士学位论文 制可能是糖尿病时心肌毛细血管密度下降、微血管数目减少，使心肌内氧弥散距离显 著增加，细胞内线粒体缺氧，从而使能量合成障碍，内
10、皮细胞受损，并最终导致了微 血管内皮功能紊乱，诱导了血管内皮细胞P A l 1 m R N A 的表达；同时糖尿病时高血糖、 胰岛素抵抗、炎症因子的共同作用可直接诱导血管内皮的P A l 一1m R N A 的表达，而由 于P A I 一1 在心肌组织中主要由微血管内皮细胞表达和分泌，这将导致血液中P A l 1 水平 增加，t - P A 和P A l 1 调节失衡，局部纤溶活性受抑，使血液呈现高凝状态，增加微血 栓形成的危险性。另一方面本研究结果显示老龄糖尿病组心肌P A l 1m R N A 表达与青 年糖尿病组及青年对照组相比明显升高，老龄对照组心肌P A l 1m R N A 表达与
11、青年对 照组相比也显著升高，说明随着糖尿病的进展和增龄，P A l 1m R N A 表达也会增强， 年龄可影响P A I 1m R N A 表达。这和前期对于年龄与P A l 1 的关系研究结果相一致。研 究表明在不同年龄阶段的鼠类模型中，随着年龄的增长P A l 1 基因表达水平随之升高， 这一情况可以在多个位点、组织和器官中发现。例如在K l o t h o 突变( k l k 1 ) 鼠的血浆、 肾脏、心肌细胞、肾上腺素细胞、平滑肌纤维肌动脉硬化血管的内皮细胞中均可发现 上述变化。T a k e s h i t a 等【55 J 通过测量P A I 1 蛋白含量而得出了上述结论的，同时
12、由于 P A l 1 蛋白水平与P A l 1 m R N A 水平一致，故T a k e s h i t a 等考虑是由于随着年龄的增长 P A l I m R N A 表达水平升高所造成的。在人类观察中也己证实，在久坐的妇女【5 6 】及老 年人脐静脉内皮细胞【5 7 】中随着年龄的增长P A l 1 水平随之升高。M a r i a 等【5 8 】在对8 3 位6 0 岁老人和4 2 位健康百岁老人研究中发现与6 0 岁老年人相比，百岁老人有更高的血浆 P A l 一1 水平( 7 3 1 + 1 3 。9 v s 2 3 7 士1 4 7 n m l ，P 3 0k g m 2 ) 分
13、 别增加患静脉血栓的1 7 倍及2 4 倍1 1 8 】。几项研究直接表明脂肪组织是P A l 1 的重要来 源。其中内脏脂肪堆积比皮下脂肪产生更多血浆P A l 1 。通过手术切除脂肪组织及低 脂饮食后，血浆P A l 1 水平明显降低。脂肪组织诱导P A l 一1 基因表达增强其机制尚不明 确，目前研究表明脂肪组织通过炎性反应刺激P A l 1 的表达，肥胖是一种慢性低程度 的炎性反应状态，急性反应期，脂肪组织中脂肪细胞以自分泌或者远分泌的方式释放 促炎性细胞因子( I L 1 、I L 6 、T N F a ) 促进了P A I 1 的表达【1 9 1 。另一项研究表明脂肪 组织是通过分
14、泌肿瘤坏死因子a ( T N F a ) ，刺激P A l 一1 在脂肪细胞、血管平滑肌细胞 ( V S M C s ) 等其他组织的表达。值得注意的是当抑制T N F 0 【时也能抑制P A 1 的表达，但 是在给体瘦的动物注射T N F Q 时，脂肪中的P A l 1 基因表达增强【2 0 1 。这些研究说明肥 胖时P A l 1 基因表达的增强是多种细胞因子作用的结果，而不是脂肪组织直接刺激了 P A l 1 基因表达的增强。 2 5 遗传因素 遗传因素对P A l 1 活性有重要影响。在P A l 1 启动子区一6 9 4 位置上有两个等位基因 4 G 5 G 。M a r i o n
15、 等【2 l 】通过研究澳大利亚人群中P A l 1 基因多态性与糖尿病肾病( D i a b e t i c N e p h r o p a t h y ，D N ) 和糖尿病视网膜病变( D i a b e t i cR e t i n o p a t h y ，D R ) 相关性时发现， D R 患者主要含有4 G 4 G 基因型，而D N 患者与基因多态性无明显相关性。E z z i d i 等【2 2 】 进一步研究认为P A I 1 水平的变化与其基因位点不同有关，但这并不说明D R 的严重 性，只能作为可能增J 3 H D R 严重性的一个标记物。S a e l y 等 2 3
16、1 对冠脉造影显示有稳定斑 块的6 7 2 人随访5 年发现，含4 G 4 G 基因型非糖尿病患者中发生冠脉狭窄事件比含 4 G 4 G 基因型糖尿病患者明显增多。并推论含4 G 5 G 基因型糖尿病患者更易发生心血 管事件。 2 6 增龄因素 研究证实随着糖尿病的进程和增龄，血浆P A l 1 水平明显升高，说明年龄因素影响 P A l 1 。H i d e f u m i 等【2 4 】对雄性W B N 依o b 糖尿病小鼠的研究发现，从3 个月到1 2 个月， 随月龄增加凝血因子含量及P A l 1 水平逐渐增加，t - P A 水平逐渐减低。M a r i a 等【2 5 1 通过 研究8 3 位6 0 岁老人和4 2 位健康百岁老人，发现与6 0 岁老年人相比，百岁老人有更高的 血浆P A l 一1 水平( 7 3 1 + 1 3 9v s 2 3 7
