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1、发酵综合实验指导书前 言一、课程的性质与任务发酵综合实验是生物技术及应用专业的一门专业基础必修实践类课程。发酵综合实验课程作为发酵工程教学的重要部分，一直是课程建设的重点，在实现学生总体培养目标中占有重要地位。本课程着重培养学生的专业核心技能，通过本课程的开展可以培养学生对发酵等工业的兴趣及将来从事发酵生产的能力。由于到目前为止，国内虽已有一些关于发酵工程的教材或专著，但多偏重于介绍基本原理及相关应用，还欠缺实验操作方面的有关教材，尤其缺少高职层次的相关教材，此外，目前不同学校的生物技术及应用专业教学都有不同的侧重点和方向性，所以没有一本特别合适本专业发酵综合实验课程与我院学生特点的教程，因此
2、根据轻工业高等专业学校生物技术及应用专业发酵方向发酵综合实验教学大纲编写适用讲义。本讲义以我院生化工程系生物技术专业学生为服务对象，知识点与学生实际层次吻合，便于学生将有关发酵基本的实验技能真正掌握，能为后继专业课学习及从事相关工作打下扎实的基础。发酵综合实验指导书在内容上涵盖了发酵工程的诸多新领域，与学科的发展相适应，激发了学生的实验兴趣。实验安排上，首先通过精心选择、安排基本技能训练的实验内容，做到少而精，便于学生掌握，而且在进一步在综合实验环节中，这些基本技能训练重复出现，基本技能得到了巩固和加强；其次，以大小、难易等不同项目为教学单元，增加了综合性、设计性的实验内容。通过实验系统化的训
3、练，学生的动手能力、综合问题的分析能力得到极大的提高，对于专业核心技能的掌握也有大量的提高，并在实验中培养学生的团队协作能力、调查分析能力、查阅资料能力、方案设计能力及创造性思维等，使学生的知识体系更加合理化、系统化。发酵综合实验指导书按照两个层次编制实验内容：(1)基础实验 ：将发酵过程按工艺流程整合成培养基配制、菌种诱变、种子扩培、发酵培养、产物分析等单元实验模块，与理论课程同步开设，作为课程实验的基本环节。(2)综合实验 ：指具有综合度并带有一定设计性的大实验，是课程实验的提高环节，实验内容涵盖实际生物产品生产及过程控制检测等内容，学生可以结合自己的兴趣选做其中部分内容。本讲义最主要的特
4、点是以实践性环节为中心内容，只在必要的时候介绍一些必需的理论知识；选材方面，注意将国外该领域的最新实验技术与我国现有的实验材料以及研究方法有机结合起来，所选取的这些实验方法和技术是科学研究工作中经常应用的技术，可操作性强；另外，结合学生知识基础和学习特点以及现有教学设备，合理编排内容，学习起来更容易，技术掌握更简单，方法更实用。二、实验项目第一篇 基础实验第一章 菌种管理实验技术第一节 菌种的分离纯化与性能测定实验一 厌氧菌的分离和培养实验二 土壤中产醋酸菌种的分离筛选实验三 酸乳制品中的乳酸菌分离实验四 啤酒酵母的分离实验五 柠檬酸产生菌的分离实验六 啤酒酵母发酵力的测定实验七 酵母菌热死温
5、度的测定实验八 酵母菌凝集力的测定第二节 微生物育种实验一 紫外线诱变育种绘制细胞存活率和突变率曲线实验二 利用原生质体融合选育耐热性淀粉酶产生菌第二章 生物培养工艺过程实验技术第一节 培养基制备实验技术实验一 啤酒麦芽汁制备实验第二节 发酵罐的使用方法实验一 小型发酵罐的使用及分批发酵第三节 生物工艺过程实验实验一 淀粉质原料酒精发酵实验二 中温-淀粉酶的摇瓶发酵实验实验三 摇床培养确定菌体培养和营养条件第三章 发酵生产过程中的微生物学检测实验一 原料的检查实验二 曲的检查（ 酱油种曲孢子数及发芽率的测定）实验三 酒曲、发酵醪及成品的检测第四章 生物工艺过程相关参数的检测第一节 菌体量的测定
6、实验一 微生物菌体量的测定实验二 微生物菌体密度的测定第二节 容积氧传递系数的测定实验一 亚硫酸盐法测定发酵罐体积溶氧系数KLa第五章 生物物质分离与精制实验技术第一节 柠檬酸提取实验一 柠檬酸提取第二节 糖化酶提取实验一 糖化酶的发酵和提取实验第六章 生物物质成分分析实验技术第一节 水分测定 实验一 烘箱干燥法测水份 第二节 糖的测定实验一 原料中粗淀粉的测定实验二 还原糖的测定第三节 含氮量的测定实验一 氨基酸总量测定第二篇 综合实验第一章 发酵工艺过程综合实验实验一 淀粉酶解糖液的制备及谷氨酸发酵罐发酵实验二 毛霉的分离和豆腐乳的制备实验三 甜酒酿的制作实验四 果酒的制作实验五 啤酒的实
7、验室酿造及代谢曲线的测定第二章 发酵产品成分分析综合实验实验一 小香槟(汽酒)中总糖的测定实验二 牛乳酸度的测定实验三 酱油中山梨酸、苯甲酸的测定三、教学组织本课程的教学组织主要是在校内实训基地开展发酵实验。实验分为按照两个层次，即基础实验和综合实验。 基础实验：将发酵过程按工艺流程整合成菌种管理实验技术、生物培养工艺过程实验技术、发酵生产过程中的微生物学检测、生物工艺过程相关参数的检测、生物物质分离与精制实验技术、生物物质成分分析实验技术培养基配制等单元实验模块，属于发酵基本实验技能，作为课程实验的基本环节。综合实验 ：指具有综合度并带有一定设计性的大实验，是课程实验的提高环节，实验内容涵盖
8、实际生物产品生产及过程控制检测等内容，学生可以结合自己的兴趣选做其中部分内容。整体内容安排是由浅向深的过渡，由基本向综合的过渡，由基本的小项目向有难度的大项目的过渡，逐步提高能力训练与培养。 实习教学时间为20学时，一般安排在课堂教学之后，便于学生综合应用所学课堂理论知识到实际之中，提高分析问题和解决问题的能力，地点在发酵实训室，要求学生分组（人）在指导教师指导下进行发酵实验操作，并在规定时间观察成效，最后写出相应实验报告。指导教师根据学生表现、实验操作的规范与否、以及实验实训报告水平等综合评定成绩，将其作为课程成绩的重要组成部分，并单独记载实验成绩。通过实验课程的教学，学生能强化理论知识，学
9、会综合运用所学知识解决实际问题，提高专业核心能力。四、实验课时的分配实验：20学时（一周） 第一篇 基础实验第一篇 基础实验第一章 菌种管理实验技术微生物是发酵的原动力。在发酵工业中，要取得生产的高效益，就要有优良的生产菌种。因此，在发酵生产中，只有获得一个优良的菌种以及提供一套保证该菌种能发挥最大潜在生产能力的工艺过程，才能获得发酵生产的成功。一般需要根据需要分离出相应的菌种，但野生型菌种产量都比较低，不能直接用于生产，现在发酵工业生产中所使用的菌种，几乎都是经过人工选育出来的优良菌种。因此，选育优良的生产菌种并保持其稳定的生产特性，是发酵工业中极其重要的工作。第一节 菌种的分离与纯化从自然
10、界中分离筛选微生物菌种，是我们获得优良新菌种最基本、最主要的方法，因此，发酵工业菌种的分离筛选是一项重要的、长期而繁重的工作。自然界存在着各种各样的微生物，尤其是土壤中微生物种类齐全，是微生物的大本营。因此可以从土壤中分离到几乎所有微生物。另外，不同的自然界环境中生存的微生物优势菌种也不同。各种食品、农副产品等营养组成不同，从中可以分离出不同的微生物。发酵工业菌种常用的分离源有被污染的生产或科研菌种、生产中长期使用的菌种、发酵食品用菌种、动物肠道菌群、经各种育种方法处理过的微生物材料和自然界菌种样品。自然界的微生物是混杂生存的，要从中分理出一种微生物，不仅需要考虑分离源应含有较多数量的目的菌，
11、还要在分离操作中使之与其他菌种相互分开。对于样品中含量较低的菌处，要针对其生物学特点合理设计分离方法，如富集培养、选择培养、利用其特殊的生理反应产生特定的生长现象等，以便于从大量杂菌中选出目的菌种。纯种分离技术是微生物学中重要的基本技术之一。分离是指从混杂的微生物群体中获得单一菌株纯培养的方法。纯种(纯培养)是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂，繁殖而产生的后代。微生物的分离与纯化技术主要用于分离具有特殊功能的微生物，优良菌种及纯化被污染的菌种等。从混杂群体中分离特定微生物的常用方法有：控制分离培养基的营养成分、控制培养基的pH值、添加抑制剂、控制培养温度、控制空气条件
12、、对样品进行特殊处理等。常用的纯种分离方法有平板划线分离法、简单平板分离法、稀释分离、涂布分离法、毛细管分离法、显微操作单细胞分离法等。实验一 厌氧菌的分离和培养一、实验目的和要求1、了解厌氧微生物的生长特性；2、观察厌氧微生物（双歧杆菌）的形态特征；3、掌握厌氧微生物的滚管分离、培养与计数技术。二、实验原理 目前培养厌氧微生物的简便而有效的技术有：厌氧箱培养技术；厌氧罐培养技术；厌氧袋培养技术；亨盖特厌氧滚管技术。这里主要介绍亨盖特厌氧滚管技术。 亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特（Hungate）于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。此后这项技术又经历了几
13、十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一整套完整技术。而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。亨盖特厌样滚管培养技术不仅可用于有益厌氧菌如双歧杆菌等的分离、与活菌培养计数，还可以用于有害腐败菌（如酪酸菌）或病原菌（如肉毒梭状芽孢杆菌）的分离与鉴定。 三、实验材料 1、样品 双歧酸奶（液体）、双歧杆菌制剂（固体）。 2、培养基 改良MRS培养基，PTYG培养基。 具体配方如下：（1）乳酸细菌培养基（MRS）蛋白胨 10.0 g牛肉膏 10.0 g酵母膏 5.0 g柠檬酸氢二铵（NH4）2HC6H5O7 2.0 g葡萄糖(C6H1
14、2O6H2O) 20.0 g吐温80 1.0 mL乙酸钠（CH3COONa3H2O） 5.0 g磷酸氢二钾（K2HPO43H2O） 2.0 g硫酸镁（MgSO47H2O） 0.58 g硫酸锰（MnSO4H2O） 0.25 g琼脂 18.0 g蒸馏水 1000 mLpH 6.2-6.6115高压灭菌1520mim备用。 当乳酸菌生长代谢出乳酸后，会使pH下降而使颜色由绿变为黄绿，也由于pH值降低再加上抗生素及严氧培养的作用，所以一般的微生物不容易在此培养基上生长，因此十分容易鉴别乳酸菌。改良MRS培养基：MRS培养基中添加促生长物质 Y 0.3，还原剂 B 0.25。（2）PTYG培养基胰蛋白胨 5 g酵母提取物 10 g大豆蛋白胨 5 g葡萄糖 10g吐温-80 1 mL盐溶液 40mL
