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1、华中科技大学 硕士学位论文 小麦花粉特异性基因TaPSG719启动子的功能分析 姓名：金莲 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：何光源 20090520 华中科技大学硕士学位论文 华中科技大学硕士学位论文 I 摘摘 要要 本文对小麦花粉特异性基因 TaPSG719 启动子启动基因表达的组织特异性进行 了鉴定，在植物基因调控理论之启动子研究方面取得了一定的进展，同时为建立小 麦雄性不育系奠定了理论基础。 在本实验室已克隆出来的小麦花粉特异性基因 TaPSG719 启动子 （Genbank 序列 号：FJ497025）的基础上，本文采用 PCR 技术扩增出 TaPSG719
2、启动子的两个片段， 分别长 1.0kb 和 1.7kb 左右。 这两个片段插入 T 载体后， 先后用限制性内切酶 Bam HI 和 Hind III 酶切，酶切产物分别与用同样的限制性内切酶处理后的质粒 pBI121 的大 片段相连接。由于质粒 pBI121 携带 GUS 基因，成功构建的质粒载体分别命名为 p1.0GUS 和 p1.7GUS。将这两个载体转化农杆菌，再利用农杆菌介导转化法将启动 子片段和报告基因 GUS 的融合基因导入烟草，组织培养获得转基因植株。提取再生 植株叶片的全基因组 DNA 分别做相应的启动子片段和 GUS 基因的 PCR 扩增以筛选 转基因阳性植株。筛选出转基因植
3、株后对转基因植株和阴性对照植株的根、茎、叶 片、萼片、花瓣、花柱头、未成熟花粉和成熟花粉进行 GUS 组织染色。 实验结果： 对载体 p1.0GUS 和 p1.7GUS 的 PCR 检测和随后的测序结果表明 载体构建成功； 再生植株的 PCR 检测结果表明融合基因已经整合到烟草基因组中； GUS 组织染色后，阴性对照植株的各个组织都不显蓝色，阳性对照植株各个组织 均为蓝色，转入启动子片段和 GUS 融合基因的转基因烟草中除花粉显蓝色外其余均 不显蓝色；染色后，转入融合基因的转基因烟草中未成熟花粉染色后显现出很深 的蓝色，成熟花粉中只有很少花粉粒出现蓝色。这种结果的出现显然是由于小麦花 粉特异性
4、基因 TaPSG719 启动子片段调控下 GUS 基因组织特异性表达造成的。在转 入融合基因的烟草植株的花粉组织的不同的发育时期，GUS 基因的表达水平也存在 较大的差异。这些充分表明 TaPSG719 启动子具有调控基因时空特异性表达的功能。 关键词：关键词：TaPSG719 基因启动子；载体构建；农杆菌；烟草 华中科技大学硕士学位论文 华中科技大学硕士学位论文 II ABSTRACT The tissue-specific expression identification of the gene regulated by wheat pollen-specific gene TaPSG7
5、19s promoter was carried out in this paper, and some progress in the promoter study in plant gene regulation theory was obtained, which is a base for male sterile line construction. This paper is based on the cloned promoter of the gene TaPSG719 (Genbank ID: FJ497025) by our laboratory, and two frag
6、ments of the promoter were amplified by PCR, which are about 1.0 kb and 1.7 kb in length, respectively. Both fragments were digested by restriction endonuclease Bam HI first and then Hind III after they were introduced into T-vector. Meanwhile, vector pBI121 was treated exactly the same way with tho
7、se enzymes. These two fragments then were linked to the longer fragment of digested vector pBI121. As the vector pBI121 has a GUS gene, the vectors obtained successfully were named p1.0GUS and p1.7GUS, respectively. Two vectors were transformed into agrobacterium, and the transformed agrobacterium w
8、as used to bring the fusion gene of promoter fragment/reporter gene GUS into tobacco. Transgenic plants were gained by tissue culture. The gDNA were extracted from the regenerated plants leaf. PCR with different primers were carried out to select positive ones. Then GUS histochemistry stain was done
9、, the material included positives ones, negative ones, and transgenic ones with the fusion gene of promoter fragment/ GUS, and the tissue stained were root, caulis, leaf, sepal, immature pollen, mature pollen and stigma. Experiment result: Identification of p1.0GUS and p1.7GUS by PCR and later seque
10、ncing showed that the vectors were constructed successfully; Identification of regenerated plants by PCR proved that the foreign gene had inserted into the genome of tobacco; After GUS histochemistry stain, no tissue of the negative tobacco turned blue and positive ones gave a completely opposite re
11、sult, and in the transgenic ones with the fusion gene only pollen turned blue; In the transgenic ones with the fusion gene， immature pollen turned deep blue after stain, while only very few of the mature pollen 华中科技大学硕士学位论文 华中科技大学硕士学位论文 III turned blue. That gene GUS displayed tissue-specific expres
12、sion is obviously the result of the regulation of the fragments of the promoter. The expression activity of GUS gene was distinctly different in the different developing stages of pollen from the transgenic tobacco with the fusion gene. Key words: promoter of gene TaPSG719; vector construction; agro
13、bacterium; tobacco 华中科技大学硕士学位论文 华中科技大学硕士学位论文 IV 缩写符号缩写符号 GUS EDTA Tris SDS DTT DMSO 6-BA NAA YEB LB MS X-gluc Km Str Tet Cef bp -glucuronidase -葡萄糖苷酸酶 Ethylene Diamine Tetracetic Acid Disodium Salt 乙二胺四乙酸二钠 Trishydroxymethylaminomethane 三羟甲基氨基甲烷 Sodium dodecyl sulfate 十二烷基磺酸钠 Dithiothreitol 二硫苏糖醇 Di
14、methyl Sulfoxide 二甲基亚砜 6-Benzyl aminopurine 6-苄基基嘌呤 1-NapHthylacetic acid -萘乙酸 Yeast Extract and Beef Extract medium 酵母浸出物和牛肉浸膏培养基 Luria bertani medium LB 培养基 Murashige and Skoog medium MS 培养基 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide 5-溴-4-氯-3-吲哚糖醛酸 Kanamycin 卡那霉素 Streptomycin 链霉素 Tetracycline 四环素 cef
15、otaxime 头孢霉素 base pair 碱基对 独创性声明独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权
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