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1、HPV16 L1真核表达质粒的构建及其免疫小鼠特异性抗体的测定【摘要】 目的探讨HPV16型L1基因片段免疫小鼠的作用，以期为HPV16预防疫苗的研制奠定基础。方法利用基因工程技术构建HPV16 L1真核表达质粒pcDNA3-HPV16L1，在证明该构建系统能在真核细胞7721中有效表达后，用此质粒肌内注射免疫BALB/c小鼠，ELISA法检测小鼠血清相应抗体。结果pcDNA3-HPV16L1质粒DNA能在小鼠体内表达并诱导产生HPV16型特异性抗体。结论HPV16L1基因片段可诱导机体产生特异性抗体，为HPV核酸疫苗的研究奠定了理论和实验基础。 【关键词】 乳头瘤病毒； 人； 克隆； 分子；
2、 疫苗； 小鼠人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一类严重威胁人类健康的DNA肿瘤病毒，高危型人乳头瘤病毒HPV16的感染与宫颈癌的关系已被流行病学、组织病理学和分子生物学的众多证据所证明。研究发现在真核或原核细胞中表达的HPV16主要衣壳蛋白（L1）具有自身装配成病毒样颗粒（Virus-like particles，VLP）的特性1,与天然的病毒颗粒具有相似的结构，有很强的免疫原性和免疫综合性，可以刺激机体产生中和性抗体IgG、IgA2,能保护动物免受相同型别HPV的攻击，是目前疫苗构建中常用的保护性抗原，与重组腺病毒疫苗相比，DNA疫苗具有制备简单有效的特性，
3、是有广泛用应前景的第3代疫苗。因此本实验构建了HPV16主衣壳蛋白（L1）的真核表达质粒，在充分证明其在哺乳动物细胞中能有效表达HPV16 L1蛋白的基础上，进一步研究重组真核表达质粒的免疫原性，以探讨研制可预防HPV16感染的核酸疫苗的可行性及有效性。1 材料1.1 质粒、菌种和细胞株质粒p16L1BN1（含HPV16L1全长基因，由于修平教授构建惠赠），真核表达载体pcDNA3.0（含CMV启动子）、大肠杆菌DH5及TA克隆载体pMD18-T（大连宝生物公司产品）；7721人肝癌细胞株购于中国科学院上海细胞所。1.2 试剂限制性内切酶BamH I，Hind III，Xbal I，T4连接酶
4、，DNA Marker- EcoT141，DNA Marker- Hind III及PCR扩增试剂盒均为大连宝生物公司产品；质粒提纯及酶切片段回收试剂盒为Qiagen公司产品。Lipofectamine 2000 Reagent，胎牛血清，RPMI1640购自GIBCO公司。G418购自上海生工生物工程有限公司。鼠抗HPV16L1单克隆抗体由卞继峰博士（山东医科大学分子生物学实验室）提供，羊抗鼠IgG-HRP和TMB购自北京中山生物公司。低分子量标准蛋白质为Pharmacia公司产品。HPV16 VLPs由美国癌症研究中心Schiller教授惠赠。1.3 动物BALB/c小鼠，雌性，46周龄，
5、 体质量（202）g，购自华中科技大学同济医学院实验动物学部。2 方法2.1 PCR扩增目的片段特异性引物P1、P2序列如下：P1：GCA AGA TCT ATG TCT CTT TGG CTG CCT AGT；P2：AGC AGA TCT TTA CAG CTT ACG TTT TTT GCG上下游引物前各加入Bgl II内切酶识别序列（画线部分）。以质粒p16L1BN1为模板，按照94变性3 min，然后94 45 s，60 45s，72 1.5 min，循环30个周期后，72延伸7 min，1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。2.2 HPV16 L1 T-A克隆构建PCR产物3端多出的A碱基
6、与载体pMD18-T的5端的T碱基互补，于16连接过夜，以常规CaCl2法转化感受态DH5，在含有氨苄的LB平板上37培养过夜筛选阳性菌落，BamH I单酶切鉴定重组子pT-A16L1。2.3 HPV16 L1真核表达质粒pcDNA3-HPV16 L1的构建重组体pT-A16 L1经Hind III，Xbal I双酶切，回收HPV16 L1片段（约1.52kb）。真核表达载体pcDNA3.0同样经Hind III，Xbal I双酶切回收，与回收的HPV16 L1片段以13的摩尔比混合，16连接过夜，转化感受态DH5，在含有氨苄的LB平板上37培养过夜筛选阳性菌落。Hind III，Xbal I
7、双酶切鉴定重组质粒pcDNA3-HPV16 L1，同时进行克隆片段全长测序（上海生工生物工程有限公司完成），以检查重组质粒中克隆片段核苷酸序列的改变情况。2.4 细胞转染及筛选将7721人肝癌细胞株接种于6孔板中，37 5%CO2条件下培养至80%汇合时，用脂质体转染的方法分别导入经PEG法纯化的质粒pcDNA3-HPV16 L1和空载体pcDNA3.0，在含有G418的RPMI1640中培养48 h，筛选阳性转化细胞，G418的有效浓度为400 gml-1。2.5 表达产物的SDS-PAGE分析收集阳性转化细胞沉淀，重悬于3SDS-PAGE上样缓冲液中，100沸水煮10 min，取出20 l
8、上清液作12%SDS-PAGE，凝胶经考马斯亮蓝R-250染色，脱色后照相。2.6 Western Blot鉴定参照文献7样品制备及SDS-PAGE同上。将凝胶中蛋白质转印至硝酸纤维素膜上，100 V 1.5 h，PBS洗3次，PBS+3%BSA封闭过夜，加入PBS+3%BSA稀释的HPV16 L1单克隆抗体（11000），37 2 h，TBS洗涤3次，加入TBS+1%BSA稀释的酶标二抗（11000），37 2h，TBS洗涤3次，DAB显色。2.7 重组质粒DNA免疫小鼠实验选取46周龄BALB/c雌性小鼠，（202）g，随机分为3组，每组10只。即空白对照组（NS免疫组），质粒对照组（pc
9、DNA3.0免疫组）和实验组（pcDNA3-HPV16 L1免疫组）。免疫途径为左侧后肢股四头肌内注射。DNA量为100 g每只小鼠， 10 d后加强免疫1次。2.8 小鼠血清HPV16 L1抗体测定 在第2次免疫后第2，4，6周分3批处死小鼠，前眼球取血，分离血清，-20保存。抗体用ELISA检测。以含HPV16 VLPs 10 ngl-1的 碳酸钠缓冲液(pH9.6)包被聚苯乙烯酶标板，50 l每孔，小鼠免疫血清为第1抗体(110)，羊抗鼠IgG-HRP为第2抗体(12 000)。显色后，酶标仪450 nm处测定OD值。3 结果3.1 PCR扩增利用特异性引物扩增片段约1.52 kb，与H
10、PV16 L1基因全长相符。PCR产物两端分别带有Bgl II的酶切位点。电泳结果如图1中6。3.2 HPV16 L1 T-A克隆的构建PCR扩增产物与pMD18-T载体相连，插入方向正确的重组质粒经BamH I单酶切后为3.1 kb、1.0 kb两条片段如图1中5，经Hind III，Xbal I双酶切后释放出HPV16L1全长片段，大约1.52 kb。如图1中4所示，可见HPV16 L1片段已成功连接入pMD18-T载体。3.3 HPV16 L1真核表达质粒的构建所构建的重组质粒pcDNA3-HPV16 L1经Hind III、Xbal I双酶切，产生5.4 kb和1.52 kb两条带，与
11、载体和目的基因大小相符，见图1中2。证明HPV16 L1已成功插入真核表达载体pcDNA3.0的CMV启动子下游。3.4 测序结果测序结果进一步证实克隆基因片段插入方向正确，全长序列1 518个核苷酸无一突变。3.5 HPV16 L1表达产物的体外分析表达产物的SDS-PAGE显示，在大约55 kD的位置比阴性对照多出1条特异性蛋白条带见图2A中4，5；Western blotting分析显示在分子量为55 kD的位置上出现1条清晰的特异性反应条带，如图3B，表明表达产物能与HPV16 L1单克隆抗体特异结合，证明真核表达质粒能在真核细胞中有效表达。3.6 动物实验结果实验组小鼠注射pcDNA
12、3-HPV16 L1质粒DNA，于第2次免疫后第2，4，6周采集小鼠血清。用ELISA方法检测实验组和对照组小鼠血清中抗HPV16 L1的抗体，酶标仪处测得OD450均值见表1所示。表1 各组小鼠血清ELISA检测结果（OD450均值）（略）4 讨论 近年来的研究表明，HPV L1具有自我装配成病毒样颗粒的特性，这种病毒样颗粒刺激体产生中和性抗体，是目前最有应用前景的预防HPV感染的疫苗。研究者希望通过L1疫苗接种，增强免疫原性，激发机体产生特异的体液免疫和细胞免疫反应，从而对表达同样抗原的病毒感染发挥预防效应。此设想已通过动物实验得到证实，采用HPV16 L1重组病毒疫苗已在小鼠体内成功诱导
13、了特异性抗体的产生3。 DNA疫苗是新近发展起来的一种疫苗，受到各国学者的高度重视。相对于目前存在的多肽疫苗、重组病毒疫苗、VLPs疫苗等，以真核表达质粒为主体的DNA疫苗具有研制工艺简单、使用安全、可长期诱导免疫应答等特点，特别是肌肉注射免疫后表达量高，持续时间久，且可产生较强的T细胞反应4，因此研究HPV DNA疫苗具有更广阔的应用前景。 质粒DNA在肌肉组织中的表达量高，持续时间久。肌肉注射DNA是目前采用较多、易实施的免疫方法5。本研究在充分证实pcDNA3-HPV16 L1真核表达质粒能在7721真核细胞中有效表达L1蛋白的前提下，将pcDNA3-HPV16 L1和pcDNA3.0质
14、粒DNA分别注射小鼠，用HPV16 L1 VLP作为型特异抗原，ELISA方法检测小鼠免疫血清。实验组小鼠血清出现了型特异抗体，而对照组小鼠血清未产生型特异抗体，说明重组质粒DNA在小鼠体内产生的L1蛋白与HPV16 L1 VLP及天然HPV16 L1病毒颗粒一致，起了外源病毒抗原作用，可诱导出型特异抗体，为HPV16核酸疫苗的研制奠定了理论和动物实验基础。由于目前使用的动物模型多是以HPV16E6/E7和EjRas基因转化细胞而得到的“永生化”的细胞系，因缺少HPV16的L1/L2基因，因此疫苗的保护性研究不充分。故亟待建立HPV疫苗抗病毒和抗肿瘤的动物模型。【参考文献】 1Harald Z
15、un Hause. Cervical carcinoma and human papillomavirus: On the Road to preventing a major human cancer J.J. Nat. Cancer inst,2001,93:253.2Jochmus I, Schafer K, Kaath S, et al.Chimeric virus-like particles of the human papillomavirus type 16 as a prophylactic and therapeutic vaccineJ.Arch Med Res,1999,30:269.3Bryan JT. Developing an HPV vaccine to prevent cervical cancerand genital wartsJ.Vaccine, 2007, 25( 16) : 3001.4Harper DM, Franco EL, Wheeler C, et al. Efficacy of a bivalent L1virus-like particle vaccine in prevent
