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1、C-反应蛋白在慢性乙型肝炎中的表达2009-10-17 高艳琴袁胜涛胡锡琪汪乃经 【摘要】目的了解慢性乙型肝炎时，C-反应蛋白(CRP)在肝细胞中的表达。方法用本室建立的LBA法检测40例HBsAg阳性慢性肝炎的肝组织和15例HBsAg阴性的正常肝组织的CRP原位表达；用免疫双标记染色检测肝细胞中CRP、HBsAg的表达。结果40例肝炎标本CRP均呈阳性，表达位置和形态与HBsAg相似；免疫双标记染色显示肝细胞中CRP与HBsAg有重叠。此外，T淋巴细胞也表达CRP。结论CRP可与HBsAg形成复合物。CRP可能与慢性乙型肝炎的发病机制有关。 【关键词】C-反应蛋白肝炎，乙型毛玻璃细胞 Exp
2、ression of C-reactive protein in HBV chronic hepatitisGao Yanqin, Yuan Shengtao, Hu Xiqi, et al.School of Basic Medical Sciences, Shanghai Medical University, Shanghai 200032 【Abstract】ObjectiveTo detect the localization of CRP in liver tissue of HBV chronic hepatitis by the labelled biotin-avidin (
3、LBA) technique. MethodsThe LBA was set up in our laboratory to detect the localization of CRP in liver tissue of 40 HBsAg positive chronic hepatitis patients and 15 HBsAg negative normal individuals, as well as immunodouble labelling technique was used to detect the expression of CRP and HBsAg in he
4、patocytes. ResultsCRP positive substance appeared in all 40 HBV hepatitis samples. CRP presented a similar distribution and morphological pattern as HBsAg did in hepatocytes. The expression of CRP and HBsAg in hepatocytes was eclipsed by immunodouble labelling technique. The expression of CRP could
5、be detected also in lymphocytes. ConclusionCRP-HBsAg compound can be formed in hepatocytes. CRP maybe play a role in the pathogenic mechanism of HBV chronic hepatitis. 【Key words】C-reactive proteinHepatitis BGround glass cell C-反应蛋白(C-Reactive Protein，CRP)是一种主要由肝脏合成的蛋白质。正常人血液中的含量甚微，当机体处于炎症急性发作阶段，血液中
6、CRP水平急剧升高，当炎症缓解时，CRP水平也迅速下降，恢复至正常水平。本研究应用本室建立的CRP生物素-亲和素免疫酶标法(LBA)1，检测慢性乙型肝炎时CRP在肝细胞中的定位表达，并探讨CRP在慢性肝炎发病机制中的作用。 材料与方法 一、标本来源 选取上海医科大学中山医院1994年手术切除肝细胞癌标本，其中HBsAg阳性40例，男性34例，女性6例，男女比例为5.71。平均年龄为51.611.9岁；15例肝血管瘤中男6例，女9例，男女比例为11.5，平均年龄为46.910.3岁。癌旁肝组织取材距离肿瘤1cm，癌旁肝组织慢性肝炎按1994年英国肝脏病理学家Scheuer新分类2，40例癌旁肝组
7、织中7例为G1，10例为G2，12例为G3，11例为G4。另选手术切除血管瘤的瘤旁肝组织15例作为正常肝组织对照组，即为G0。全部标本按常规福尔马林固定，石蜡包埋连续切片。 二、试剂 兔抗人CRP的制备，CRP抗体的生物素标记(B-Ab)，亲和素辣根过氧化物酶偶联物(A-HRP)的制备参照本室建立的方法1，工作浓度分别为11 000、1100。抗人HBsAg、兔抗羊IgG、羊PAP(均由华美公司提供)的工作浓度分别为：11 500、1200、1200。LCK，L26，UCHL1(均由DAKO公司提供)的工作浓度均为1100。ABC试剂盒(由VECTOR公司提供)按说明使用。 三、免疫组化检测
8、(一) CRP、HBsAg、淋巴细胞标记CRP染色用LBA法，HBsAg染色用PAP法，淋巴细胞标记LCA、L26、UCHL1染色采用ABC法。 (二) CRP、HBsAg免疫双重染色先用LBA法定位CRP，DAB染色；然后用PAP法定位HBsAg,4-氯-1-萘酚显色。 (三) 免疫组化显色根据强度、范围分以下几级：1(阴性)；2(弱阳性)；3(阳性)；4(强阳性)。 结果 一、HBsAg染色结果 40例血清HBsAg阳性的肝细胞癌之癌旁肝组织HBsAg染色均呈阳性结果。HBsAg阳性信号位于肝细胞胞质内，呈包涵体型、全浆型和膜型簇状或散在分布(附图)。肝癌细胞HBsAg阳性率为57.5%(
9、23/40)。15例血管瘤旁肝组织HBsAg呈阴性结果。 附图HBsAg免疫酶染色显示肝硬化结节中部分肝细胞阳性，呈包涵体型1040。右下角为连续切片CRP染色显色与HBsAg阳性位置、形态相对应4040。 二、CRP染色结果 CRP阳性信号也位于胞质内，其形态和分布与HBsAg相似，呈包涵体型、全浆型和膜型(图右下角)。肝细胞CRP阳性程度与慢性肝炎炎症程度(G分级)有关(见附表)。肝癌细胞也表达CRP，阳性率为42.5%(17/40)。肝细胞碎片状坏死区和血窦旁部分淋巴细胞CRP阳性，淋巴细胞标记免疫组化染色显示CRP阳性的淋巴细胞主要为T淋巴细胞。胆管上皮细胞不表达CRP。15例血管瘤旁
10、肝组织CRP呈阴性结果。 三、CRP和HBsAg免疫双重染色结果 部分肝细胞胞质的染色既不呈棕黄色，也不呈蓝色，而是这两种颜色的调和色棕褐色，尤其是HE切片所见的毛玻璃肝细胞，双重染色呈棕褐色 附表慢性乙型肝炎CRP表达 炎症程度 G 分 级 例数 免疫组化染色分级 1 2 3 4 平均 G0 15 14 1 1.07 G1 7 1 5 1 2.00* G2 10 1 9 2.90* G3 12 8 4 3.33* G4 11 4 7 3.64* 与G0比较：* P0.05，*P0.01 包涵体型；一些肝细胞的部分胞质呈CRP阳性的棕黄色；另外部分呈HBsAg阳性的蓝色；也可见胞质呈棕黄色或蓝
11、色，而胞膜呈棕褐色；还可见少数肝细胞呈CRP棕黄色或HBsAg蓝色单独阳性。 讨论 CRP分子是由非共价连接的五个相同的亚基组成，电镜下呈环状对称的五聚体，每个亚基由187个氨基酸残基组成，亚基不带糖链，亚基内有2个半胱氨酸以二硫键连接，无自由巯基存在3。CRP与IgG一级结构的氨基酸排列顺序有一定程度的相似之处，其是一种血浆蛋白，正常时含量甚微。当机体处于外伤、感染、移植排异等急性炎症反应时，CRP的水平急骤上升，并随组织损伤程度加剧而增加，当急性炎症反应缓解时，CRP的水平也迅速下降4。自1978年Kushner5首次报道应用免疫组化法定位检测实验性急性炎症的家兔肝脏CRP，表明CRP由肝
12、脏合成及分泌以来，尚未见人体肝脏资料。我们应用免疫组化LBA法显示CRP在正常肝组织中基本不表达(15例中仅1例呈弱阳性)，而在慢性乙型肝炎的肝细胞中有表达。随着慢性肝炎炎症程度加重，肝细胞中CRP表达强度增强。人体肝细胞中CRP表达的形态除胞浆型和胞膜型与实验动物家兔一样外，尚可见包涵体型，其与HBsAg在肝细胞内表达的形态和位置极其相似，且阳性切片的连续切片HE染色显示与CRP相对应的肝细胞为典型的毛玻璃肝细胞。应用LBA法DAB显示CRP(棕黄色)和PAP法4-氯-1-萘酚显示HBsAg(蓝色)的免疫双重染色，结果肝细胞胞质中的包涵体既不呈棕黄色，也不呈蓝色，而是这两者的调和色棕褐色。这个结果表明CRP和HBsAg在肝细胞中阳性位置可重叠，提示CRP与HBsAg在肝细胞内可呈结合状态。众所周知，HBsAg是在肝细胞的滑面内质网(SER)中复制，而肝细胞合成CRP的位置恰好也在SER6，这样CRP通过自身的配体结合位点与HBV复制过程中多余的HBsAg形成复合物，使HE染色中肝细胞胞质凝集成细颗粒状即毛玻璃肝细胞。
