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1、第九章 重组DNA导入细胞 Transferring DNA to cells,转化 转导 转染 感染 结合 其它,一、转化 transformation,一种遗传转移方式,1928年 Griffith 首次发现,肺炎双球菌（Diplococcus pneumoniae）,少量无毒RII（无荚膜，粗糙） 大量杀死有毒SIII（有荚膜，光滑）,混合注射小白鼠,小鼠死亡可分离出活SIII细胞,RII细胞 + SIII DNA,即一来自一个细菌细胞(供体)的DNA(片段)被另一个细胞(受体)所吸收(随后同受体染色体一起进行重组),对DNA的吸收，仅在受体生长周期中的一个短暂阶段。能够吸收DNA的细胞
2、，称作感受态细胞(competent cell),肺炎链球菌产生的感受态因子能将感受态授于同一菌株的非感受态，而枯草芽胞杆菌的感受态因子似乎不能将感受态传给非感受态细胞。感受态因子可能是一种自溶酶(autolytic enzyme)，它能够产生或暴露结合DNA的受体位点,感受态的确定似乎涉及某些胞内蛋白质的合成,在肺炎链球菌和流感嗜血杆菌中，在最大感受态时期，群体中感受态细胞可达100%。 在B. subtilis中感受态细胞的比例似乎不超过10-15%,在转化中有功能的DNA是双链或ssDNA， 线状或环状,（一）CaCl2转化法 核心，目标细胞在CaCl2H2O溶液中浸泡一段时间,E.co
3、li：100mM,E.coli: DH5, TG1, XL-1Blue, JM105,吸附(adsorb)：感受态细胞和DNA混合，冰上30min 热激(heat shock)：42 90 sec 恢复：12min 复苏：37 150rpm摇床 45-60 min,感受态细胞的保藏：10%甘油0.1M CaCl2 -70 ,Mg2+, Co2+, Ru2+ , DMSO二甲基亚砜等可提高效率,转化效率 107-109 cell/gDNA,转化子（transformant）,（二）原生质体转化法 protoplast,G+细菌，特别是芽胞杆菌(bacillus)，酶母(yeast) Lysozy
4、me / 等渗环境下，脱细胞壁,细胞壁再生,原生质体融合,(三)电转化法（electroporation） 10%甘油(glycerol)或蔗糖(sucrose)，含(或不含)Mg2+ 离子 2.5 KV/0.2cm 25F 200-400,Gene Pulse, Bio-Rad 公司,由噬菌体将细菌基因由一个细菌（供体）转移到另一个细菌（受体）的过程,二、转导（transduction）,（一）普遍性转导 (generalized transduction),phage在供体烈解中，部分供体DNA被包装，当感染受体菌时，若感染复数(multiplicity of infection)小于1时
5、，缺陷phage可将供体DNA注入受体(此时原phage DNA不感染) 形成新的表型,完全转导：由噬菌体导入的DNA片断通过双交换整合到受体染色体上与寄主染色体同步复制，则称为完全转导(complete transduction)，如Salmonella typhimurium P22，反之，则为流产转导(abortive transduction),(二) 局限性转导 Specialized (or restricted) transduction, phage 不正确切离，以10-6比率存在 产生dgal or dbio,当dgal(低感染复数)感染gal- E.coli时得到gal+
6、E.coli,低频转移,高频转导,高感染复数时， 和10-6dgal+ 共同感染gal- E.coli(+dgal)得gal+双重溶源菌烈解half 和dgal,Transductant 转导子,attP,gal,attB,bio,chromosome,integrate,attL,gal,bio,attR, prophage,a) integrate,b) excision,prophage,attB,attP,attL,attR,Int+xls, 转导噬菌体的形成,gal,chlD,pgl,att,BP,N,RmmA,J,att,PB,bio,uvrB,chlA,正常切离, 转导噬菌体的形
7、成,不正常切离,gal,chlD,pgl,att,BP,N,RmmA,J,att,PB,bio,uvrB,chlA, 转导噬菌体的形成,d,dgal,gal,chlD,pgl,att,BP,N,RmmA,J,att,PB,bio,uvrB,chlA,pgl,chlD,gal,att,BP,N,A,m,m,R,m,A,gal,chlD,pgl,att,BP,N,R,m,gal-,gal-, ,gal+,gal+,gal+,gal+,gal-,稳定,不稳定,双重溶源菌的形成,PP,BP,gal,gal,BB,BP,gal,gal,BP,PB,gal,BP,gal,BP,PB,gal,dgal,双重
8、溶源菌进入裂解状态可产生两种噬菌体,感受态细胞经分离出来的噬菌体核酸所感染，随后能产生出正常噬菌体后代，叫转染,三、转染 (transfection),细菌 M13(or M13mp18) 动物细胞 SV40,感染复数（multiplicity of infection, MOI） 指在一定体系中，病毒颗粒与敏感细胞的比率,四、感染（infection）,病原微生物在寄主组织内立足的状态,如细菌的感染，Virus/ phage的感染,phage包装，cosmid感染,概念交叉,转染：病毒核酸的转移 转化：普通DNA的转移,感染：病毒的侵染 转导：强调转移方式,三亲本杂交(triparental
9、 mating) a suitable conjugative plasmid-RP4 providing necessary transfer functions: pGJ28 or pDS4101 trans-acting factor， tra基因 pBR322 derivative 含Bom基因序列(位点的nic位点),五、结合conjugation,结合：细菌结合，纤毛原虫结合，藻类结合， 免疫学结合,细菌结合：通过两细胞之间的直接接触，遗传物质从一个细胞转移到另一个细胞的过程，广泛存在于细菌中。如F、R,三杂本： cyanobacteria E.coli J53(RP-4) E.coli HB101(pBR322 derivative and helper plasmid) pGJ28 or pDS4101,根癌农杆菌介导的转化 Ti 质粒 介导 植物 丝状真菌,六、其它,注射、 基因枪、花粉管导入,
